蛋白质分分离纯化和表征培训课件

蛋白质分分离纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有具有两性解离性质两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的度与溶液的pH有关，有关，pH越低，碱性解离度越大，越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，升高，则解离情况相反。则解离情况相反。2蛋白质分分离纯化和表征在特定在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等称为该蛋白质的等电点（电点（pI）。）。蛋白质的等电点蛋白质的等电点有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。基团结合，影响等电点。无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点称为等离子点(isoionic point,或称等离点或称等离点)。等离子点是。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。每种蛋白质的一个特征常数。3蛋白质分分离纯化和表征几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点4蛋白质分分离纯化和表征二、蛋白质的分子大小与分子量的测定二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围蛋白质的分子量的范围:61031106 Da5蛋白质分分离纯化和表征（一）根据化学组成测定最低相对分子量（一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例例：肌肌红红蛋蛋白白和和血血红红蛋蛋白白含含铁铁量量均均为为0.335%,计算二者的相对分子质量。计算二者的相对分子质量。最低相对分子量最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量铁的百分含量 铁的原子量铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。理计算蛋白质的最低分子量。6蛋白质分分离纯化和表征（二）渗透压法测定相对分子量（二）渗透压法测定相对分子量 渗透压法测定渗透压法测定Mr操作简单，操作简单，Mr在在10-100 kDa时较准，但不能区别时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一蛋白质分子是否均一。渗透压公式：渗透压公式：Mr=RTlimc0c(c=质量浓度，质量浓度，g/mol)7蛋白质分分离纯化和表征（三）沉降分析测定（三）沉降分析测定Mr超速离心机最大转速超速离心机最大转速:6000080 000r/min,相当于位于距相当于位于距转轴中心转轴中心10 cm处、单位质量处、单位质量(1g)分子所受到的离心力分子所受到的离心力(离离心场强度心场强度)为为400 000 g700 000 g.沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂且与溶剂密度和黏度有关密度和黏度有关.单位离心场强度的沉降速度称为单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数沉降系数,用用s(小写小写)表示表示:8蛋白质分分离纯化和表征 蛋蛋白白质质、核核酸酸、核核糖糖体体和和病病毒毒等等的的沉沉降降系系数数介介于于11013到到2001013秒秒之之间间。为为了了使使用用方方便便，以以1013秒秒为为一一个个沉沉降降系系数数的的单单位位，称称为为斯斯维维得得贝贝格格单单位位（Svedberg unit），或或称称沉沉降降系系数数单单位位，用用S表表示示。如如人人血血红红蛋蛋白白的的S为为4.461013秒，即秒，即4.46S。蛋蛋白白质质的的沉沉降降系系数数(s)与与相相对对分分子子质质量量(Mr)的的关关系系可可用斯维得贝格方程表达用斯维得贝格方程表达:摩尔气体常数摩尔气体常数(8.314JK-1mol-1);热力学温度热力学温度(K),旧称绝对温度旧称绝对温度蛋白质的扩散系数蛋白质的扩散系数(cm2/s),数值上等于当数值上等于当浓度梯度为浓度梯度为1个单位时在个单位时在1 s内通过内通过1 cm2面面积的蛋白质质量积的蛋白质质量溶剂的密度溶剂的密度(g/cm3)偏微比体积偏微比体积(cm3/g)又称偏微比容又称偏微比容,蛋白质蛋白质溶于水的偏微比容约溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g沉降系数沉降系数9蛋白质分分离纯化和表征（四）凝胶过滤法测定（四）凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术的技术，同时可以测定蛋白质分子量。同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的Ve Ve（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积），并，并以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得作图得一直线，再测出待测样品的一直线，再测出待测样品的VeVe，查标准曲线即可确定分，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对子量，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出待作图得一直线，再测出待测样品的测样品的VeVe，查标准曲线即，查标准曲线即可确定分子量。可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测10蛋白质分分离纯化和表征（五）（五）SDS-PAGE法测定法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。分子量。11蛋白质分分离纯化和表征SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用破坏蛋白氢键和疏水相互作用,巯基乙醇能打开二硫巯基乙醇能打开二硫键键,SDS和巯基乙醇存在下和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解寡聚蛋白质解离成亚基离成亚基)处展开状态处展开状态.SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体.在在一定条件下一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比与大多数蛋白质的结合比:1.4g SDS/1 g蛋白质蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS.SDS 与蛋白质结合后与蛋白质结合后:第一第一,SDS 阴离子使多肽链覆盖上阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷相同密度的负电荷,远超过蛋白质原有电荷量远超过蛋白质原有电荷量,掩盖了不同掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别蛋白质间原有的电荷差别;第二第二,改变蛋白质的天然构象改变蛋白质的天然构象,使大多数蛋白质采取类似的形状使大多数蛋白质采取类似的形状.因此在因此在 SDS 存在下的电存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.12蛋白质分分离纯化和表征聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-PAGE，迁移率不受蛋，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形白质原有的电荷、分子形状等因素影响状等因素影响,但凝胶具分但凝胶具分子筛效应子筛效应.因此，迁移率与因此，迁移率与相对分子质量相对分子质量(Mr)之关系之关系:常数常数相对迁移率：相对迁移率：样品迁移距离样品迁移距离/前沿前沿(染料染料)13蛋白质分分离纯化和表征蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层双电层 水化层水化层三、胶体性质与蛋白质的沉淀三、胶体性质与蛋白质的沉淀1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋蛋白白质质颗颗粒粒大大小小属属于于胶胶体体粒粒子子的的范范围围(1-100nm)。又又由由于于其其分分子子表表面面有有许许多多极极性性基基团团，亲亲水水性性极极强强，易易溶溶于于水水成为稳定的亲水胶体溶液。成为稳定的亲水胶体溶液。14蛋白质分分离纯化和表征 蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液的的稳稳定定性性是是有有条条件件的的，相相对对的的。假假若若改改变变环环境境条条件件，破破坏坏其其水水化化膜膜和和双双电电层层，蛋蛋白白质质亲亲水水胶胶体体便便失失去去稳稳定定性性，发发生生絮絮结结沉沉淀淀现现象象，这这既既是是所所谓谓的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀作作用。用。盐析法（盐析法（salting out）：中性盐（中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）等）蛋白质脱去水蛋白质脱去水化层。化层。优点：不引起蛋白质变性。优点：不引起蛋白质变性。盐溶（盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。加的现象。2蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀15蛋白质分分离纯化和表征 有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：极极性性有有机机溶溶剂剂（甲甲醇醇，乙乙醇醇，丙丙酮酮）脱脱去去水水化化层层以以及及降低介电常数降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。而增加带电质点间的相互作用。条件：低温操作，缩短时间。条件：低温操作，缩短时间。重重金金属属盐盐沉沉淀淀法法:当当溶溶液液pHpI,蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带负负电电荷荷,易易与与重金属离子重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等)生成沉淀。生成沉淀。生生物物碱碱试试剂剂和和某某些些酸酸类类沉沉淀淀法法:生生物物碱碱试试剂剂能能引引起起生生物物碱碱沉沉淀淀的的一一类类试试剂剂。当当溶溶液液pHpI时时,蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带正正电电荷荷 易与生物碱试剂易与生物碱试剂,酸根负离子反应酸根负离子反应沉淀沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质16蛋白质分分离纯化和表征加热变性沉淀法加热变性沉淀法 原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层损坏了水化层 用途：制豆腐（加热用途：制豆腐（加热+少量盐卤）少量盐卤）17蛋白质分分离纯化和表征四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则前处理：细胞破碎前处理：细胞破碎粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等细分级分离：层析、电泳、结晶细分级分离：层析、电泳、结晶 蛋白质纯化测总目标：增加蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力纯度或比活力18蛋白质分分离纯化和表征动物材料剔除结缔组织、脂肪组织动物材料剔除结缔组织、脂肪组织;种子材料应先去壳种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染和种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子脱脂油料种子脱脂.选择适当方法选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机电动捣碎机或匀浆器或超声或匀浆器或超声););植物组织植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素纤维素酶酶););细菌细胞细菌细胞(超声超声,与砂研磨或与砂研磨或溶菌酶溶菌酶).).选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来.如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的,用超声波用超声波或去污剂使膜结构解聚或去污剂使膜结构解聚,用适当的介质提取。用适当的介质提取。前处理前处理:19蛋白质分分离纯化和表征五、蛋白质分离纯化的一般方法五、蛋白质分离纯化的一般方法 根据分子量：如沉降速度法离心根据分子量：如沉降速度法离心 根据密度：沉降平衡法离心根据密度：沉降平衡法离心 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状：凝胶过滤根据分子量和分子形状：凝胶过滤 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷：等电点沉淀根据电荷：等电点沉淀20蛋白质分分离纯化和表征 透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。大分子物质的过程叫透析。超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。时要用切向流过滤法。（一）根据分子大小不同的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的分离纯化方法磁力搅拌器磁力搅拌器透析液透析液装有蛋白溶液的透析袋装有蛋白溶液的透析袋搅拌子搅拌子 透析透析 超滤超滤21蛋白质分分离纯化和表征离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。于颗粒的质量、大小和密度。密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。在离心管中被分离成各自的区带。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心22蛋白质分分离纯化和表征常常用用于于生生成成密密度度梯梯度度的的介介质质是是蔗蔗糖糖、聚聚蔗蔗糖糖（Ficoll），分分离离核核酸酸时时还还常常用用CsCl作作为为介质。介质。23蛋白质分分离纯化和表征凝胶过滤法凝胶过滤法 常常用用凝凝胶胶：交交联联葡葡聚聚糖糖、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶，琼琼脂脂糖糖（sepharose 或或 Bio-Gel A）；）；凝凝胶胶网网孔孔大大小小一一定定，只只允允许许相相应应大大小小的的分分子子进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，大大分分子子则则被被排排阻阻在在外外，即即分分级级分分离离范范围围或或排阻极限排阻极限;大大分分子子从从颗颗粒粒间间隙隙流流下下来来，洗洗脱脱液液体体积积小小。小小分分子子在在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大；颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大；用用洗洗脱脱体体积积同同标标准准分分子子量量的的蛋蛋白白质质的的比比例例关关系系测测定定蛋蛋白质分子量；白质分子量；24蛋白质分分离纯化和表征25蛋白质分分离纯化和表征（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法影影响响蛋蛋白白质质溶溶解解度度的的外外部部因因素素很很多多，其其中中主主要要有有：溶溶液液的的pH、离离子子强强度度、介介电电常常数数和和温温度度。溶溶解解度度归归根根结结底底取取决于他们本身的分子结构。决于他们本身的分子结构。1.通过改变溶液通过改变溶液pH值的等电点沉淀法值的等电点沉淀法2.通过改变溶液离子强度的盐析、盐溶通过改变溶液离子强度的盐析、盐溶3.有机溶剂的分级沉淀有机溶剂的分级沉淀4.通过改变温度的沉淀法通过改变温度的沉淀法26蛋白质分分离纯化和表征在在等等电电点点pH条条件件下下，蛋蛋白白质质为为电电中中性性，其其物物理理性性质质如如导导电电性性、溶溶解解度度、黏黏度度、渗渗透透压压等等都都表表现现为为最最低低值值，易易发发生生絮絮结结沉沉淀淀。因因此此，等等电电点点性性质质常常被被用用于于蛋蛋白白质质的的分离制备，被称为等电点沉淀技术。分离制备，被称为等电点沉淀技术。等电点沉淀等电点沉淀27蛋白质分分离纯化和表征盐溶与盐析盐溶与盐析盐盐溶溶：一一般般在在低低盐盐浓浓度度的的情情况况下下，蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度随随盐盐浓度的升高而增加，这种现象称为浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶盐溶；盐盐析析:当当盐盐浓浓度度升升高高到到一一定定程程度度后后，蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度又又随随着着盐盐浓浓度度的的升升高高而而降降低低，结结果果使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀析析出出，这这种种现象称为现象称为盐析盐析;同同一一浓浓度度盐盐溶溶液液中中，不不同同蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度不不同同，借借此此可可达到彼此分离的目的。达到彼此分离的目的。盐溶原理盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。盐盐析析原原理理：盐盐浓浓度度增增高高到到一一定定数数值值后后，水水活活性性降降低低，水水化化膜膜相相继继被被破破坏坏，最最终终引引起起蛋蛋白白质质分分子子间间相相互互聚聚积积并并从从溶液中析出溶液中析出28蛋白质分分离纯化和表征 温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 0-40之之间，大大部部分分球球状状蛋蛋白白质的的溶溶解解度度随随温温度度的的升升高高而增加。而增加。有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法降降低低水水溶溶液液的的介介电电常常数数，破破坏坏大大分分子子周周围围水水膜膜，使使溶溶质质溶解度降低溶解度降低;利利用用不不同同蛋蛋白白质质在在不不同同浓浓度度的的有有机机溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度不不同同而而使使蛋蛋白白质质分分离离的的方方法法，有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法。经经常常使使用用的的有机溶剂是乙醇和丙酮；有机溶剂是乙醇和丙酮；易使蛋白质和酶变性，操作必须在易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温低温条件下进行。条件下进行。29蛋白质分分离纯化和表征电泳电泳:在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电极移动，这种现象称为电泳。原则上按电泳的原理来分，可分为：原则上按电泳的原理来分，可分为：（三）根据电荷不同的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法自由界面电泳自由界面电泳区带电泳区带电泳 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜）滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜）粉粉末末电电泳泳（淀淀粉粉、纤纤维维素素粉粉、硅硅胶胶粉粉，粉粉末末与与适适当当溶溶剂剂调调和，铺板）和，铺板）细细丝丝电电泳泳，如如尼尼龙龙丝丝和和其其它它人人造造丝丝电电泳泳，这这是是一一类类微微量量电电泳泳 凝凝胶胶电电泳泳，最最常常用用的的支支持持介介质质是是聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶和和琼琼脂脂糖糖凝胶凝胶30蛋白质分分离纯化和表征 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)31蛋白质分分离纯化和表征浓缩胶样品 分离胶 在在PAGE中，中，除了一般的电荷除了一般的电荷效应外，还有凝效应外，还有凝胶对样品的分子胶对样品的分子筛效应和浓缩效筛效应和浓缩效应，应，三种效应共三种效应共同起作用，同起作用，使样使样品的分离效果大品的分离效果大大提高。大提高。32蛋白质分分离纯化和表征Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%33蛋白质分分离纯化和表征A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field.Protein solution is added and electric field is reapplied.After staining,proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.等电聚焦等电聚焦(IEF)pH梯度制作：利用两性电解质梯度制作：利用两性电解质(商品名商品名:Ampholine)，多氨基多羧，多氨基多羧酸系列两性化合物同系物的复杂混合物，它们有相近但不同的酸系列两性化合物同系物的复杂混合物，它们有相近但不同的pH和和pI值，在电场作用下，自然形成值，在电场作用下，自然形成pH梯度梯度.电电泳泳就就是是在在凝凝胶胶中中加加入入两两性性电电解解质质从从而而构构成成从从正正极极到到负负极极pH逐逐渐渐增增加加的的pH梯梯度度，处处在在其其中中的的蛋蛋白白分分子子在在电电场场的的作作用用下下运运动动，最最后后各各自自停停留留在在其其等等电电点点的的位位置置上上，测测出出蛋蛋白白分分子子聚聚焦焦位位置置的的pH值值，便便可可以以得得到到它它的的等电点。等电点。35蛋白质分分离纯化和表征First dimensionIsoelectric focusingIsoelectric focusing gel is placed on SDSpolyacrylamide gel.Second dimensionSDS-polyacrylamidegel electrophoresis双向电泳双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)36蛋白质分分离纯化和表征37蛋白质分分离纯化和表征 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。同电荷的蛋白质进行分离的方法。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交发生交换而结合在树脂上。换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生发生交换而结合在树脂上。交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。到分离纯化的目的。离子交换层析离子交换层析38蛋白质分分离纯化和表征阳离子交换剂：阳离子交换剂：CM-纤维素：纤维素：-O-CH2COOH P-纤维素：磷酸基纤维素：磷酸基阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基纤维素：二乙基氨基乙基 AE-纤维素：氨基乙基纤维素：氨基乙基39蛋白质分分离纯化和表征40蛋白质分分离纯化和表征亲和层析亲和层析利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的离提纯的目的。抗原和抗体抗原和抗体 激素和受体蛋白激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白41蛋白质分分离纯化和表征配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体42蛋白质分分离纯化和表征六、蛋白质的含量测定与纯度六、蛋白质的含量测定与纯度 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝法。（一）蛋白质的含量测定（一）蛋白质的含量测定43蛋白质分分离纯化和表征1.双缩脲法双缩脲法双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。上肽键的物质均会发生双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质可以与在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2形成紫红色络合物，形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关的分子量和氨基酸组成无关。44蛋白质分分离纯化和表征2.福林酚法福林酚法福福林林酚酚法法主主要要基基于于蛋蛋白白质质在在碱碱性性溶溶液液中中能能与与铜铜形形成成复复合合物物，此此复复合合物物以以及及芳芳香香族族氛氛基基酸酸残残基基可可以以还还原原酚酚试试剂剂而而产产生生蓝蓝色色，再再与与标标准准蛋蛋白白质质(通通常常采采用用牛牛血血清清白白蛋蛋内内)比比色色定定量。量。福福林林酚酚试试剂剂法法灵灵敏敏度度高高，但但是是如如果果样样品品和和标标准准蛋蛋白白质质的的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。45蛋白质分分离纯化和表征3.紫外吸收法紫外吸收法 蛋蛋白白质质组组成成中中常常含含有有酪酪氨氨酸酸等等芳芳香香族族氨氨基基酸酸，在在紫紫外外光光280nm波波长长处处有有最最大大吸吸收收峰峰，故故可可用用280nm波波长长的的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。46蛋白质分分离纯化和表征4.考马氏亮蓝法考马氏亮蓝法考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250是是一一种种染染料料，在在游游离离状状态态下下呈呈红红色色，与与蛋蛋白白质质结结合合则则呈呈现现蓝蓝色色。在在一一定定范范围围内内，溶溶液液在在595nm波波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。本本法法试试剂剂配配制制简简单单，操操作作简简便便，是是一一种种常常见见的的蛋蛋白白质质快快速速微量测定方法。微量测定方法。47蛋白质分分离纯化和表征（二）蛋白质纯度鉴定（二）蛋白质纯度鉴定 常常用用电电泳泳法法(IEE、PAGE和和SDS-PAGE)、HPLC法法、免疫学方法等免疫学方法等.此外此外,N-末端分析末端分析也用于纯度鉴定也用于纯度鉴定 各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基 酸测定一种，溶解度曲线单转折点。酸测定一种，溶解度曲线单转折点。48蛋白质分分离纯化和表征