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蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v第1页/共59页序列测定的基本方法学将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对，就可以得到肽链的一级结构。v第2页/共59页序列测定一般步骤纯度要求纯度要求:纯度在纯度在97%以上。以上。双向电泳；凝胶电泳；双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活；末端测定；纯化至恒定酶活；肽谱分析。肽谱分析。分子量测定分子量测定多肽链的组成，二硫键的断裂。多肽链的组成，二硫键的断裂。蛋白质的氨基酸的组成。蛋白质的氨基酸的组成。蛋白质的配基蛋白质的配基蛋白质的端基分析蛋白质的端基分析进行正常的序列测定进行正常的序列测定*-SH，-S-S-+HCOOOH-SO3Hv第3页/共59页蛋白质和肽的氨基酸组成蛋白质和肽的氨基酸组成v第4页/共59页蛋白质的水解蛋白质的水解酸水解酸水解6 6 mol/Lmol/L的的盐盐酸酸或或4 4 mol/Lmol/L的的硫硫酸酸,105-110,105-110水水解解2020小时。小时。优点优点:不容易引起水解产物的消旋化。不容易引起水解产物的消旋化。缺点缺点:TrpTrp被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏；有有-OH-OH的的Ser或或ThrThr小部分被分解；小部分被分解；AsnAsn和和GlnGln侧链的酰胺基侧链的酰胺基-COOH-COOH。注注:加加入入0.1-1%0.1-1%巯巯基基乙乙醇醇和和0.05-0.1%0.05-0.1%苯苯酚酚,Tyr或或ThrThr收收率提高率提高v第5页/共59页碱水解碱水解5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。缺点缺点:水水解解过过程程中中许许多多AAAA都都受受到到不不同同程程度度的的破破坏坏，产产率率不高。不高。水解水解产物发生消旋化产物发生消旋化。优点优点:TrpTrp在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。蛋白质的水解蛋白质的水解v第6页/共59页磺酸水解磺酸水解4mol/L4mol/L甲甲基基氨氨酸酸(含含0.2%0.2%-吲吲哚哚乙乙胺胺)色色氨氨酸酸可可回收回收90%90%以上以上,SerSer与与ThrThr的回收接近定量值。的回收接近定量值。用用二二硫硫苏苏糖糖醇醇还还原原胱胱氨氨酸酸，再再用用过过量量的的连连四四硫硫酸酸钠氧化，得到钠氧化，得到S-S-磺基半胱氨酸再测定。磺基半胱氨酸再测定。缺点缺点:水解环境需中性，条件苛刻。水解环境需中性，条件苛刻。水水解解液液中中含含较较多多碳碳水水化化合合物物时时，色色氨氨酸酸容容易易被被破破坏。坏。优点优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。蛋白质的水解蛋白质的水解v第7页/共59页磺酸水解磺酸水解4mol/L4mol/L甲甲基基氨氨酸酸(含含0.2%0.2%-吲吲哚哚乙乙胺胺)色色氨氨酸酸可可回收回收90%90%以上以上,SerSer与与ThrThr的回收接近定量值。的回收接近定量值。用用二二硫硫苏苏糖糖醇醇还还原原胱胱氨氨酸酸，再再用用过过量量的的连连四四硫硫酸酸钠氧化，得到钠氧化，得到S-S-磺基半胱氨酸再测定。磺基半胱氨酸再测定。缺点缺点:水解环境需中性，条件苛刻。水解环境需中性，条件苛刻。水水解解液液中中含含较较多多碳碳水水化化合合物物时时，色色氨氨酸酸容容易易被被破破坏。坏。优点优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。蛋白质的水解蛋白质的水解v第8页/共59页蛋白质的水解蛋白质的水解酶的水解酶的水解选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。以使蛋白质水解成游离的氨基酸。优点：优点：其他水解不稳定的氨基酸，如其他水解不稳定的氨基酸，如TrpTrp、AsnAsn、GlnGln等，都可以等，都可以用此方法。用此方法。缺点：缺点：不容易彻底水解，也许回收率。不容易彻底水解，也许回收率。蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。v第9页/共59页氨基酸的分离与含量测定氨基酸的分离与含量测定v第10页/共59页v第11页/共59页特殊氨基酸的测定特殊氨基酸的测定v第12页/共59页色氨酸的测定紫外吸收法紫外吸收法Trp与与Tyr在在280nm附近的光吸收成一定比附近的光吸收成一定比例，可用方程计算出例，可用方程计算出Trp的含量：的含量：对二甲基氨基苯甲醛法对二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下下有最大吸收。此吸收值与有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用含量成正比。可用此法测量此法测量Trp含量。含量。TyrTrp(A280Trp*4815)(A288Trp*5690)(A280Tyr*385)(A288Tyr*1280)v第13页/共59页巯基含量测定巯基含量测定DTNB法(5.5-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)反应产物反应产物(CNT)在在412nm处可产生光吸收，处可产生光吸收，根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。量。Protein-+R-S-S-R(DTNB)Protein-SHProtein-S-S-R+RS-Protein-S-S-Protein+RS-(CNT)-NO2-COOH-Rv第14页/共59页末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定v第15页/共59页N-末端的测定 sanger反应反应Edman反应反应丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS)法法氨肽酶法氨肽酶法v第16页/共59页SangerSangerSangerSanger反应反应反应反应2 2 2 2、4 4 4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFBDNFBDNFB）反应）反应）反应）反应v第17页/共59页EdmanEdman反应反应-PITC-PITC与多肽的反应与多肽的反应+v第18页/共59页EdmanEdman反应反应苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC）法：）法：多肽多肽 or 蛋白质末端蛋白质末端NH2PITCPTC多肽多肽 or 蛋白质蛋白质有机溶剂有机溶剂N末端的末端的PTCAA发生环化发生环化 生成苯乙内酰硫脲的衍生物生成苯乙内酰硫脲的衍生物 脱离肽链脱离肽链 除去除去N末端末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。后剩下的肽链仍然是完整的。（因为，（因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）的引入，只使第一个肽键稳定性降低）干燥干燥/薄层薄层 气相气相 HPLC层析层析 色谱色谱v第19页/共59页丹磺酰氯（DNS）法 v第20页/共59页封闭的封闭的N末端的测定末端的测定v第21页/共59页v末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出少一个Gln的肽。释放的肽可用Edman等方法等正常方法测定。N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用甲酰基酶除掉。封闭的封闭的N端测序端测序v第22页/共59页v第23页/共59页v第24页/共59页v第25页/共59页v第26页/共59页v第27页/共59页v第28页/共59页v第29页/共59页v第30页/共59页v第31页/共59页v第32页/共59页v第33页/共59页v第34页/共59页v第35页/共59页C C末端分析末端分析a)a)肼解法肼解法b)b)还原法：硼氢化锂还原剂还原法：硼氢化锂还原剂c)c)羧肽酶法（最有效、常用）羧肽酶法（最有效、常用）v第36页/共59页肼解法肼解法vv第37页/共59页还原法还原法肽链C末端AA硼氢化锂氨基醇水解 C末端氨基酸+氨基醇 色谱法鉴定v第38页/共59页羧肽酶法羧肽酶法 羧肽酶法：羧肽酶法：最有效，最常用的测最有效，最常用的测C端殘基方法端殘基方法性质：肽链外切酶，专一地从肽链的性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降端逐个降解，释放出游离解，释放出游离AA。常用常用4种羧肽酶：种羧肽酶：A胰脏胰脏 能释放除能释放除Pro,Arg,Lys之外所有之外所有C末端殘基末端殘基B胰脏胰脏 只能水解以碱性只能水解以碱性AA,Arg,Lys为为C末端的肽键末端的肽键C柑桔中柑桔中Y面包酵母面包酵母 v第39页/共59页v第40页/共59页肽链的专一性水解及肽片段的分离纯化v第41页/共59页化学裂解法溴化氰断裂 羟胺断裂 v第42页/共59页溴化氰断裂溴化氰断裂溴化氰断裂溴化氰断裂v第43页/共59页羟胺断裂羟胺断裂！能专一性地断裂！能专一性地断裂！能专一性地断裂！能专一性地断裂-Asn-AsnGlyGly之间的肽键之间的肽键之间的肽键之间的肽键 v第44页/共59页酶解法酶解法:胰蛋白酶胰蛋白酶 R R1 1=Lys=Lys、Arg RArg R2 2=Pro=Pro（抑制水解抑制水解）糜蛋白酶糜蛋白酶 R R1 1=Phe=Phe、TrpTrp、TyrTyr；LeuLeu、MetMet、HisHis胃蛋白酶胃蛋白酶 R R1 1和和/或或 R R2 2=Phe=Phe、Leu Leu、Trp Trp、TyrTyr以及以及 其他疏水残基其他疏水残基嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 R R2 2=Leu=Leu、IleIle、PhePhe、ValVal、TrpTrp、TyrTyr、Met Met v第45页/共59页所所得得混混合合肽肽段段可可通通过过凝凝胶胶过过滤滤、凝凝胶胶电电泳泳、离离子子交交换换柱柱层层析析、HPLCHPLC等等方方法法分离纯化，再进行下面的测序等操作。分离纯化，再进行下面的测序等操作。v第46页/共59页肽段的肽段的AA顺序测定顺序测定v第47页/共59页Edman化学降解法化学降解法第一步：偶联反应v第48页/共59页Edman化学降解法化学降解法第二步：环化断裂反应第二步：环化断裂反应v第49页/共59页Edman化学降解法化学降解法第三步：转化反应第三步：转化反应v第50页/共59页其他测定蛋白质氨基酸序列的方法其他测定蛋白质氨基酸序列的方法酶解法酶解法 氨肽酶氨肽酶 羧肽酶羧肽酶质谱法质谱法由核酸推断蛋白质序列由核酸推断蛋白质序列v第51页/共59页肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定v第52页/共59页肽谱重迭法 从不同方法断裂所得到的肽段中重叠的部分着手，得到肽的氨基酸序列。v第53页/共59页实例有一个十肽，有一个十肽，N末端及末端及C末端已事先测定分末端已事先测定分别为别为Ala及及Val。糜蛋白酶水解糜蛋白酶水解Ala Phe+Gly Lys AsnTyr+ArgTrp+HisVal 胰蛋白酶水解胰蛋白酶水解 Ala PheGly Lys+AsaTyrArg+TrpHisVal 因此，得到蛋白质的序列为：因此，得到蛋白质的序列为：Ala PheGly Lys AsnTyrArgTrpHisVal v第54页/共59页二硫键的确定v第55页/共59页蛋白质用胃蛋白酶充分处理蛋白质用胃蛋白酶充分处理 点样、滤纸中央点样、滤纸中央 PH6.5 第一向电流第一向电流 肽段按大小及电荷分开肽段按大小及电荷分开 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（SS断裂）断裂）含二硫键肽段被氧化成氧化成含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽一对含半胱氨磺酸的肽 滤纸旋转滤纸旋转90PH6.5第二向电流第二向电流 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷 偏离对角线偏离对角线 茚三酮茚三酮 AA顺序分析顺序分析确定二硫键的位置确定二硫键的位置 v第56页/共59页v第57页/共59页由下列信息求八肽的序列。由下列信息求八肽的序列。（a a）酸水解得）酸水解得 AlaAla，ArgArg，LeuLeu，MetMet，PhePhe，ThrThr，2Val2Val（b b）SangerSanger试剂处理得试剂处理得DNP-AlaDNP-Ala。（c c）胰蛋白酶处理得）胰蛋白酶处理得AlaAla，ArgArg，Thr Thr 和和 LeuLeu，MetMet，PhePhe，2Val2Val。当以。当以SangerSanger试剂处理时分别得到试剂处理时分别得到DNP-AlaDNP-Ala和和DNP-ValDNP-Val。（d d）溴化氰处理得）溴化氰处理得 AlaAla，ArgArg，高丝氨酸内酯，高丝氨酸内酯，ThrThr，2Val2Val，和，和 LeuLeu，PhePhe，当用，当用SangerSanger试剂处理时，分别得试剂处理时，分别得DNP-AlaDNP-Ala和和DNP-LeuDNP-Leu。答：Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe v第58页/共59页一个含有一个含有1313个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为：个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为：Ala,Arg,2 Asp,Ala,Arg,2 Asp,2Glu,3Gly,Leu,3Val2Glu,3Gly,Leu,3Val。部分酸水解后得到以下肽段，其序列由。部分酸水解后得到以下肽段，其序列由EdmanEdman降解确定，试推断原始寡肽的序列。降解确定，试推断原始寡肽的序列。（a a）Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-AlaAsp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala（b b）Val-Asp-Val-Asp-GluVal-Asp-Val-Asp-Glu（c c）Val-Asp-ValVal-Asp-Val（d d）Glu-Ala-Leu-Gly-ArgGlu-Ala-Leu-Gly-Arg（e e）Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu（f f）Leu-Gly-ArgLeu-Gly-Arg 答：该肽链的序列可以通过将肽片段的相同序列重叠排列起来获得整个序列。v第59页/共59页
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