蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件

蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化1一、概述一、概述二、酶的提取二、酶的提取三、酶的分离纯化三、酶的分离纯化四、酶的结晶四、酶的结晶五、浓缩与干燥五、浓缩与干燥六、酶纯化步骤的设计及评价六、酶纯化步骤的设计及评价酶的提取、分离和纯化一、概述酶的提取、分离和纯化2 一、概述一、概述 1-1 1-1 酶提取与分离纯化的定义酶提取与分离纯化的定义 将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与其它物质分开，从而获得所需酶的技术再与其它物质分开，从而获得所需酶的技术过程过程 *酶的纯化程度根据需要而定酶的纯化程度根据需要而定 *纯化方法多种多样，为获得较好的效纯化方法多种多样，为获得较好的效果往往是果往往是2 2种或种或2 2种以上联合应用种以上联合应用 一、概述 1-1 酶提取与分离纯化的定义31-2 1-2 提取纯化之目的提取纯化之目的1)1)酶催化功能的应用酶催化功能的应用2)2)酶学研究酶学研究 酶的结构、功能、催化机制、催化动力学酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等酶的生物合成及其调控规律等 1-3 1-3 纯化的必要性纯化的必要性1)1)生物细胞中同时存在多种多样的酶生物细胞中同时存在多种多样的酶2)2)多酶可能作用于同一个底物多酶可能作用于同一个底物3)3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的酶在生物细胞中的分布并不是均一的1-2 提取纯化之目的4二、酶的提取二、酶的提取（extraction)extraction)2-1 2-1 了解所分离酶在细胞中的分布了解所分离酶在细胞中的分布 1 1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到2 2、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性反应具有一定顺序性 二、酶的提取（extraction)2-1 了解所分离酶在细5v真核细胞内酶的分布真核细胞内酶的分布细胞膜：细胞膜：ATPATP酶、腺苷酸环化酶等酶、腺苷酸环化酶等细胞核：细胞核：DNADNA聚合酶、连接酶和聚合酶、连接酶和RNARNA聚合酶等聚合酶等线粒体：线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNADNA聚聚合酶、合酶、RNARNA聚合酶等聚合酶等高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶溶酶体：各种水解酶等溶酶体：各种水解酶等叶绿体：参与光合作用形成叶绿体：参与光合作用形成ATPATP、NADPHNADPH有关的酶有关的酶类、与暗反应有关的酶系类、与暗反应有关的酶系真核细胞内酶的分布6线粒体主要酶的分布（约有线粒体主要酶的分布（约有120120种酶）种酶）部部 位位酶酶 的的 名名 称称外外 膜膜单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-NADH-细胞色素细胞色素C C还原酶、还原酶、脂类代谢有关的酶（酰基辅酶脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A A合成酶、脂肪酸激酶等）合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：单胺氧化酶特征酶：单胺氧化酶膜膜 间间 隙隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亚硫酸氧化酶腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亚硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶特征酶：腺苷酸激酶内内 膜膜细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADHNADH脱氢酶、肉碱酰基脱氢酶、肉碱酰基转移酶、转移酶、-羟丁酸和羟丁酸和 -羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、ATPATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体特征酶：细胞色素（特征酶：细胞色素（c c）氧化酶）氧化酶基基 质质柠檬酸合成酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸酶、谷氨酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶复合体、天冬氨延胡索酸酶、谷氨酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶复合体、天冬氨酸氨基转移酶、蛋白质和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系酸氨基转移酶、蛋白质和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：苹果酸脱氢酶特征酶：苹果酸脱氢酶线粒体主要酶的分布（约有120种酶）部 位酶 72-2 2-2 起始材料的选择起始材料的选择 原则：选取酶含量高的材料原则：选取酶含量高的材料 可以是天然的动植物可以是天然的动植物 或人工培养的微生物、动植物细胞等或人工培养的微生物、动植物细胞等 *注意材料的生长阶段注意材料的生长阶段 *注意酶在生物体内的富集区域注意酶在生物体内的富集区域 由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂2-2 起始材料的选择 原则：选取酶含量高的材料82-3 2-3 细胞膜和细胞壁的破碎细胞膜和细胞壁的破碎1 1、主要方法：、主要方法：2-3 细胞膜和细胞壁的破碎1、主要方法：9 1 1）1）10蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件11 2 2）2）12蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件13对热稳定：SOD在88时,15-30分钟内对酶活性的影响不大，一般杂蛋白在55以上时容易变性。(3)等电聚焦差速-区带（RateZonal，R-Z）1、浓缩：是从低浓度溶液中除去水分或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程离子交换层析的基本步骤1、PAGE检测离心(3000rpm),10min，弃上清如：胰蛋白酶（pI=8.原则：选取酶含量高的材料叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶类、与暗反应有关的酶系离心(3000rpm),10min，弃沉淀获得的酶质量最高的是冷冻干燥(3)有机溶剂沉淀法溶酶体：各种水解酶等能进入微孔的小分子不断地进出于一个个凝胶颗粒的微孔，做无定向的分子扩散运动（布朗运动），因而其向下移动的速度就很慢；细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、肉碱酰基转移酶、-羟丁酸和-羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体改变溶液的pH（改变结合基团的电荷）常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、甲醇等圆葱中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。干燥后的物质稳定性好，利于保存、运输和使用蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交换剂之间的离子键）的常用方法：l超声波破碎法超声波破碎法对热稳定：SOD在88时,15-30分钟内对酶活性的影响不14 3 3）3）15 4 4）4）16（1）作为静脉注射用酶就不能有热源；6-4 纯化步骤的定量评价2、酶活性测定（终点法）二、酶的提取（extraction)酶的均一性没有一个绝对的标准，实际工作中是采用相对的纯度标准(如层析纯、PAGE纯、HPLC纯）24孔板按1ml/孔加入含3mm的2-PEG反应液，加入0、0.上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50。*酶蛋白稳定存在的pHpI，用阴离子交换剂在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。1-2 提取纯化之目的*离子交换凝胶:葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，交换容量更大2.*阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解离出氢离子（H+)与其它阳离子进行交换，故称（如：当欲分离的不同颗粒的 根据酶分子的化学性质进行检测在酶的分离中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；*新型凝胶材料：superose，superdex取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀改变pH、离子强度、介电常数等实现的沉淀分离：常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶结晶分离；离心(3000rpm),10min，弃上清酶RNA与互补的RNA2 2、选择原则、选择原则如酶法+超声（1）作为静脉注射用酶就不能有热源；2、选择原则如酶法+超声17 2-4 2-4 酶的提取酶的提取 1 1、定义、定义 在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料，在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料，使酶充分溶于其中的过程。使酶充分溶于其中的过程。2 2、提取液的选择、提取液的选择 根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液 *极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶 *酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。2-4 酶的提取 1、定义182-4 2-4 酶的提取酶的提取3 3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶液进行抽提液进行抽提4 4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂肪可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂肪或磷脂膜分离；或磷脂膜分离；高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解析下来。析下来。2-4 酶的提取3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用192-5 2-5 主要的提取方法主要的提取方法1 1、盐溶液提取、盐溶液提取 该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取 常用的盐浓度：常用的盐浓度：0.02-0.05mol/L0.02-0.05mol/L，大多数，大多数P P酶用该酶用该 法提取法提取 R R酶常用酶常用0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液提取。溶液提取。*盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高而增加的现象而增加的现象 *盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐浓度升高而降低的现象浓度升高而降低的现象2-5 主要的提取方法1、盐溶液提取202 2、酸溶液提取、酸溶液提取 在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法 如：胰蛋白酶（如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用可用0.12mol/L0.12mol/L的硫酸的硫酸溶液溶液3 3、碱溶液提取、碱溶液提取 在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用 如：大肠埃希菌的如：大肠埃希菌的L-L-天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（pI=4.85）可可用用pH11-12.5pH11-12.5的溶液的溶液2、酸溶液提取21 4 4、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂（乙醇、丙酮、丁醇等），如：（乙醇、丙酮、丁醇等），如：P P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果酶等用丁醇萃取，有较好效果 R R酶：可用酸苯酚溶液提取酶：可用酸苯酚溶液提取蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件22 主要的提取方法小结主要的提取方法小结地 主要的提取方法小结地235 5、影响酶提取的其它重要因素、影响酶提取的其它重要因素v温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的扩散速度；过高则引起酶失活的扩散速度；过高则引起酶失活vpH:pH:在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高溶解度，要避开酶的等电点溶解度，要避开酶的等电点;但是，也不宜偏离但是，也不宜偏离pIpI太远（过高或过低），以免引起酶变性失活太远（过高或过低），以免引起酶变性失活5、影响酶提取的其它重要因素24v 提取液体积提取液体积 *适当增加其体积，可以提高酶的产率适当增加其体积，可以提高酶的产率 *过量，则降低过量，则降低 酶酶，增加后续分离纯化的难度，增加后续分离纯化的难度 一般为原始材料的一般为原始材料的3-53-5倍，且分倍，且分3 3次使用次使用 v 加入保护剂，以提高酶的稳定性加入保护剂，以提高酶的稳定性 如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件25 三、酶的分离纯化三、酶的分离纯化（isolation,separation)(purification)isolation,separation)(purification)3-1 3-1 分离纯化方法分类分离纯化方法分类 1 1、基于分子大小或质量、基于分子大小或质量 (1)(1)离心离心 (2)(2)透析透析 (3)(3)凝胶过滤凝胶过滤 (4)(4)超过滤超过滤 2 2、基于电荷、基于电荷 (1)(1)离子交换色谱离子交换色谱 (2)(2)电泳电泳 (3)(3)等电聚焦等电聚焦 三、酶的分离纯化（isolation,separatio26可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用(5)选择性变性沉淀法搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为204，10min酶的生物合成及其调控规律等溶酶体：各种水解酶等干燥后的物质稳定性好，利于保存、运输和使用2-1 了解所分离酶在细胞中的分布根据酶稳定性的需要：原则：选取酶含量高的材料*阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解离出氢离子（H+)与其它阳离子进行交换，故称（如：（1）作为静脉注射用酶就不能有热源；酶RNA与互补的RNA(1)离子交换色谱P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果为获得较高纯度的酶创造了条件。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性干燥时，首先是从其表面蒸发，随后才是其内部的水分子扩散到表面继续蒸发。6-4 纯化步骤的定量评价有机溶剂、硫酸铵沉淀、磷酸钙分级吸附、超滤等 3 3、基于溶解度、基于溶解度 改变改变pHpH、离子强度、介电常数等实现的、离子强度、介电常数等实现的沉淀分离：沉淀分离：(1)(1)盐析法盐析法 (2)(2)复合沉淀法复合沉淀法 (3)(3)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 (4)(4)等电点沉淀法等电点沉淀法 (5)(5)选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用 3、基于溶解度274 4、基于特异性结合位置、基于特异性结合位置/亲和力的差异亲和力的差异 亲和色谱（层析）亲和色谱（层析）5 5、其它方法（略）、其它方法（略）（1 1）基于分配系数的差异：）基于分配系数的差异：双水相系统萃取法双水相系统萃取法 （2 2）基于疏水作用的差异：疏水层析）基于疏水作用的差异：疏水层析 （3 3）在磷酸钙凝胶柱上分级吸附）在磷酸钙凝胶柱上分级吸附 （4 4）羟基磷灰石色谱）羟基磷灰石色谱 （5 5）冷冻干燥（浓缩）冷冻干燥（浓缩）4、基于特异性结合位置/亲和力的差异281 1、沉淀分离、沉淀分离3-2 3-2 常用的分离纯化方法常用的分离纯化方法1、沉淀分离3-2 常用的分离纯化方法29取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为204，10min离心(3000rpm),10min，弃沉淀 上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50。置4，3小时以上离心(3000rpm),10min，弃上清所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml 装入透析袋中对PBS充分透析（换液3次）萘氏试剂测透析外液无黄色取少许透析袋液适当倍数稀释后，测蛋白含量。例例 盐析纯化血清免疫球蛋白盐析纯化血清免疫球蛋白取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀例 盐析纯化血清免疫球蛋302 2、离心（、离心（centrifugation)centrifugation)（1 1）定义：利用离心机旋转产生的离心力，使不）定义：利用离心机旋转产生的离心力，使不同大小、不同密度的颗粒分离的技术过程。同大小、不同密度的颗粒分离的技术过程。*优点：处理量大，可达几升优点：处理量大，可达几升 *离心条件的选择：以靶酶与杂质的颗粒大小、离心条件的选择：以靶酶与杂质的颗粒大小、密度和特性的差异为依据，选择适当的离心机、密度和特性的差异为依据，选择适当的离心机、离心方法和离心条件离心方法和离心条件 2、离心（centrifugation)（1）定义：利用离心31v常速常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶结晶分离；结晶分离；v高速离心机：最大转速高速离心机：最大转速1 12.5x102.5x104 4rpmrpm。在酶的分离。在酶的分离中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；为中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；为防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速冷冻离心机；冷冻离心机；v超速离心机：最大转速达超速离心机：最大转速达2.52.512x1012x104 4rpmrpm。主要用于。主要用于DNADNA、RNARNA（酶）、蛋白质（酶）、蛋白质(酶）等生物大分子以及酶）等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化等。细胞器、病毒等的分离纯化等。（2 2）离心机的常用分类）离心机的常用分类常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等有形物32蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件33蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件345、影响酶提取的其它重要因素或人工培养的微生物、动植物细胞等在静压差作用下，小于孔径的颗粒穿过膜孔，而大于孔径者被截留。*注意酶在生物体内的富集区域*通过加入底物与亲和载体竞争酶分子二、酶的提取（extraction)细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、肉碱酰基转移酶、-羟丁酸和-羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体离心(3000rpm),10min，弃沉淀100,000g,3h常用的方法：真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥高速离心机：最大转速12.离心(3000rpm),10min，弃上清沉淀：线粒体 溶酶体 细胞膜碎片为防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速冷冻离心机；为防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速冷冻离心机；pH:在等电点条件下，酶的溶解度最小；85）可用pH11-12.稳定性、辅助因子*常用的交联剂：环氧氯丙烷3-1 分离纯化方法分类R酶：可用酸苯酚溶液提取在特定的条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。差速离心（差速离心（differential centrifugation)differential centrifugation)：即采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉：即采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离。降速度的颗粒分批分离。主要用于分离那些差异大的颗粒；操作简单、主要用于分离那些差异大的颗粒；操作简单、方便，但是分离效果较差，一般用于粗分。方便，但是分离效果较差，一般用于粗分。（3 3）离心方法的选择）离心方法的选择5、影响酶提取的其它重要因素 差速离心（differe35 差速离心举例差速离心举例沉淀：细沉淀：细胞核胞核上清液上清液沉淀：线粒体沉淀：线粒体 溶酶溶酶体体 细胞膜碎片细胞膜碎片 上清液上清液沉淀：沉淀：核糖核蛋白体核糖核蛋白体上清液：上清液：可溶性成分可溶性成分500g,10min500g,10min已经破碎的细胞已经破碎的细胞10,000g,10min10,000g,10min100,000g,3h100,000g,3h 差速离心举例沉淀：细胞核上清液沉淀：线粒体 溶酶体36 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力成连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用，使样品中的组份依据其沉降速率和密场的作用，使样品中的组份依据其沉降速率和密度的不同而分层、分离度的不同而分层、分离 这类分离又分为：这类分离又分为：差速差速-区带（区带（RateZonalRateZonal，R-ZR-Z）等密度（等密度（IsopycnicIsopycnic）/平衡密度梯度离心平衡密度梯度离心 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成连续或不连续37 A.A.差速差速-区带区带(R-Z)(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度：是根据分离的颗粒在梯度液中沉降速度的不同，在离心力作用下处于不同液中沉降速度的不同，在离心力作用下处于不同密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分离的目的。离的目的。方法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质方法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、（如蔗糖、甘油、CsClCsCl等），待分离的样品以很等），待分离的样品以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份在梯度液中沉降速率的差别，而在离心不同组份在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的的某一时刻某一时刻形成了形成了数个分别含不同组份颗粒的区数个分别含不同组份颗粒的区带。带。A.差速-区带(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度38 B.B.平衡密度梯度离心法平衡密度梯度离心法（equilibrium density equilibrium density gradient centrifigation)gradient centrifigation)/等密度梯度离心法等密度梯度离心法 当欲分离的不同颗粒的当欲分离的不同颗粒的 密度不同时，配制包含其密度不同时，配制包含其 密度范围的离心介质，在离心力作用下，不同浮力密度范围的离心介质，在离心力作用下，不同浮力密度的颗粒或沉降、或上浮，只要时间足够长，就密度的颗粒或沉降、或上浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带，从而实现分离目的位置（等密度点），形成区带，从而实现分离目的 常用介质：铯盐（氯化铯，硫酸铯，溴化铯等）常用介质：铯盐（氯化铯，硫酸铯，溴化铯等）B.平衡密度梯度离心法39P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果需还原性巯基维持催化活性的酶，可与1mmol.酶的生物合成及其调控规律等超速离心机：最大转速达2.(3)有机溶剂沉淀法(1)离子交换色谱酶活性测定的目的：反映组织、体液或提纯溶液中酶的存在与多寡（含量鉴定）。温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的扩散速度；酶蛋白与底物、竞争性抑制物和辅助因子如：大肠埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.酶可作被研究对象，或作实验和生产用试剂，不同的用途，对酶的纯度要求不同：*离心条件的选择：以靶酶与杂质的颗粒大小、密度和特性的差异为依据，选择适当的离心机、离心方法和离心条件当欲分离的不同颗粒的*盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高而增加的现象线粒体主要酶的分布（约有120种酶）*纯化方法多种多样，为获得较好的效果往往是2种或2种以上联合应用1、浓缩：是从低浓度溶液中除去水分或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程6-4 纯化步骤的定量评价定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。浓缩（concentration)与干燥（Drying)都是酶与溶剂（通常是水）分离的技术过程，是酶分离纯化的一个重要环节1-1 酶提取与分离纯化的定义 （4 4）注意离心温度和介质）注意离心温度和介质pHpH的影响，以免目的的影响，以免目的酶凝集、变性和失活，甚至引起转子和离心机其酶凝集、变性和失活，甚至引起转子和离心机其它部件的腐蚀。它部件的腐蚀。*一般一般44左右，耐热酶除外左右，耐热酶除外 *必须是酶稳定的范围内，必要时采用缓冲液必须是酶稳定的范围内，必要时采用缓冲液P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有403 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离3、过滤与膜分离41蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件42蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件43（1 1）透析）透析 透析（透析（dialysis)dialysis)：利：利用小分子物质的扩散作用小分子物质的扩散作用，使小分子不断透过用，使小分子不断透过半透膜而扩散到膜外，半透膜而扩散到膜外，而大分子则被截留于膜而大分子则被截留于膜内，从而实现分离。内，从而实现分离。用途：去除酶液中无机盐、有机用途：去除酶液中无机盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂溶剂或低分子量的抑制剂缺点：耗时；透析结束后，样品缺点：耗时；透析结束后，样品体积大，浓度低，难于工业体积大，浓度低，难于工业化生产化生产 透析膜是带有微孔的筛透析膜是带有微孔的筛子，其孔径在一定范围内子，其孔径在一定范围内是可选的；可用动物膜、是可选的；可用动物膜、羊皮纸、火棉胶等制成。羊皮纸、火棉胶等制成。（1）透析 透析（dialysis)：利用小分子物质的扩44 定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差作用下，小于孔径的颗粒穿过膜孔，术。在静压差作用下，小于孔径的颗粒穿过膜孔，而大于孔径者被截留。而大于孔径者被截留。超滤膜截留的颗粒直径为超滤膜截留的颗粒直径为2-200nm2-200nm，相等于分，相等于分子量子量1x101x103 3-5x10-5x105 5，主要用于病毒和各种生物大分子，主要用于病毒和各种生物大分子的分离。的分离。压力一般由压缩气体来维持，操作压力一般控压力一般由压缩气体来维持，操作压力一般控制在制在0.1-0.7MPa0.1-0.7MPa （2 2）超）超 滤（滤（ultrafiltration)ultrafiltration)定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差45 超滤技术的优势：超滤技术的优势：v是纯物理过程，不会改变产品的理化性能和活性是纯物理过程，不会改变产品的理化性能和活性v与离心和层析法比，处理量大，时间短，易线性与离心和层析法比，处理量大，时间短，易线性放大，成本较低放大，成本较低v收集细胞效果优良，处理量大，保持细胞活性良收集细胞效果优良，处理量大，保持细胞活性良好，操作简单好，操作简单v可以进行多种工艺的处理，如：细胞、菌体收集、可以进行多种工艺的处理，如：细胞、菌体收集、破碎后的澄清过滤、分离、浓缩、缓冲液更换等破碎后的澄清过滤、分离、浓缩、缓冲液更换等v投资小，通用性强投资小，通用性强 超滤技术的优势：46超滤技术应用：超滤技术应用：v 浓缩和透析浓缩和透析v 除热源除热源v 脱盐和缓冲液交换脱盐和缓冲液交换v 小分子处理小分子处理v 细胞收集细胞收集/澄清澄清v 病毒收集病毒收集/澄清澄清超滤技术应用：474 4、色谱法（层析法）、色谱法（层析法）4、色谱法（层析法）48（1）离子交换色谱（层析）离子交换色谱（层析）定义：定义：Ion Exchange Chromatography：以离子交以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。行分离纯化的层析方式。使用规模可大可小；纯化倍数为使用规模可大可小；纯化倍数为1010左右左右（1）离子交换色谱（层析）定义：使用规模可大可小；纯化倍数49离子交换剂分类离子交换剂分类 按其活性基团的不同来分按其活性基团的不同来分 *阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解离出氢离子（离出氢离子（H+)与其它阳离子进行交换，故称与其它阳离子进行交换，故称（如：（如：*阴离子交换剂：其活性基团为碱性基团（季胺，阴离子交换剂：其活性基团为碱性基团（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定条件下可解离出叔胺，仲胺，伯胺等），在一定条件下可解离出OH-与其它阴离子交换。如：与其它阴离子交换。如：离子交换剂分类 按其活性基团的不同来分50 按母体的种类分：母体（基质）一般是不溶性聚按母体的种类分：母体（基质）一般是不溶性聚合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、醇脂糖等合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、醇脂糖等*离子交换纤维素离子交换纤维素:是纤维素作为母体，交换容量大是纤维素作为母体，交换容量大（0.2-1.0mg/克干胶）克干胶）*离子交换树脂离子交换树脂:聚苯乙烯树脂为母体聚苯乙烯树脂为母体*离子交换凝胶离子交换凝胶:葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，交换容量更大交换容量更大2.5-4.5mg/克干胶）克干胶）51离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤52解吸方法解吸方法-洗脱原理洗脱原理 蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交换剂之间的离子键）的常用方法：换剂之间的离子键）的常用方法：加大反离子的浓度，常用的反离子是加大反离子的浓度，常用的反离子是NaCl 改变溶液的改变溶液的pH（改变结合基团的电荷）（改变结合基团的电荷）同时改变同时改变pH与离子强度与离子强度解吸方法-洗脱原理 蛋白质是通过静电引力可逆结53分离酶蛋白时交换剂选择的一般原则：分离酶蛋白时交换剂选择的一般原则：根据酶稳定性的需要：根据酶稳定性的需要：*酶蛋白稳定存在的酶蛋白稳定存在的pHpI，用阴离子交换剂，用阴离子交换剂*两种两种pH条件下均能稳定存在，二种交换剂条件下均能稳定存在，二种交换剂均可均可分离酶蛋白时交换剂选择的一般原则：54常用的盐浓度：0.*离子交换纤维素:是纤维素作为母体，交换容量大（0.酶可作被研究对象，或作实验和生产用试剂，不同的用途，对酶的纯度要求不同：酶RNA与互补的RNA对热稳定：SOD在88时,15-30分钟内对酶活性的影响不大，一般杂蛋白在55以上时容易变性。pH:在等电点条件下，酶的溶解度最小；2、酶活性测定（终点法）*也可改变pH或离子强度使结合的酶解吸由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂(3)等电聚焦*阴离子交换剂：其活性基团为碱性基团（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定条件下可解离出OH-与其它阴离子交换。圆葱中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化1-2 提取纯化之目的差速-区带(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用（2）离心机的常用分类常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、甲醇等6710-9 kat获得的酶质量最高的是冷冻干燥在4下，可将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存，10 mg/ml的浓酶液可加入25%50%甘油保存（2）作为工具酶，要求无杂酶，否则不可能有准确无误的切点，以供基因工程工作；有机溶剂、硫酸铵沉淀、磷酸钙分级吸附、超滤等 也称凝胶层析、凝胶过滤或分子排阻也称凝胶层析、凝胶过滤或分子排阻层析：是指以各种多孔凝胶为固定相，层析：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含有各种组份的相对分利用流动相中所含有各种组份的相对分子量不同而达到分离的一种层析技术子量不同而达到分离的一种层析技术 20 20世纪世纪5050年代末发展起来的快速简便的分年代末发展起来的快速简便的分离技术离技术操作简便，不需要再生处理即可反复操作简便，不需要再生处理即可反复使用，适用于分子量不同的各种物质的分离使用，适用于分子量不同的各种物质的分离（2 2）分子筛层析）分子筛层析常用的盐浓度：0.也称凝胶层析、凝胶过滤或分子排阻层55l原理：原理：其分离是因为不同大小的分子或进入或不进入其分离是因为不同大小的分子或进入或不进入凝胶微孔，因而所经过的路程不同、走过柱全长凝胶微孔，因而所经过的路程不同、走过柱全长所需的时间各异，实现彼此分离的目的：所需的时间各异，实现彼此分离的目的：能进入微孔的小分子不断地进出于一个个凝胶能进入微孔的小分子不断地进出于一个个凝胶颗粒的微孔，做无定向的分子扩散运动（布朗运颗粒的微孔，做无定向的分子扩散运动（布朗运动），因而其向下移动的速度就很慢；动），因而其向下移动的速度就很慢；不能进入微孔的大分子则只能分布于凝胶颗粒不能进入微孔的大分子则只能分布于凝胶颗粒的间隙，随溶液流动而进行垂直向下的移动，以的间隙，随溶液流动而进行垂直向下的移动，以较快的速度通过凝胶柱。较快的速度通过凝胶柱。原理：56蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化课件57l凝胶材料种类凝胶材料种类 层析用的微孔凝胶是凝胶材料与交联剂交联聚合而层析用的微孔凝胶是凝胶材料与交联剂交联聚合而成的；凝胶内部具有微细的、多孔网状结构。成的；凝胶内部具有微细的、多孔网状结构。*常用的交联剂：环氧氯丙烷常用的交联剂：环氧氯丙烷 *常用的凝胶材料：葡聚糖常用的凝胶材料：葡聚糖凝胶凝胶（SephadexGSephadexG）交联丙烯基葡聚糖（交联丙烯基葡聚糖（SephacrylSephacryl）聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel PBio-gel P）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepharose)Sepharose)*新型凝胶材料：新型凝胶材料：superosesuperose，superdexsuperdex *分离性能：凝胶孔径大小决定其能够分离的颗粒的大分离性能：凝胶孔径大小决定其能够分离的颗粒的大小；凝胶颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。小；凝胶颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。凝胶材料种类58l相对分子量不是唯一的分离依据；相对分子量不是唯一的分离依据；对于分子量相同的分子，也可依据其分子形状的不同，对于分子量相同的分子，也可依据其分子形状的不同，再加上各种物质与凝胶之间的非特异性吸附作用的差异，再加上各种物质与凝胶之间的非特异性吸附作用的差异，也可以分离。也可以分离。相对分子量不是唯一的分离依据；59分子筛层析的优缺点分子筛层析的优缺点分子筛层析的优缺点60（3）亲和色谱）亲和色谱(层析）层析）（1）定义：利用生物分子与配基之间所具有的专一）定义：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，分离纯化生物分子的技术，是而又可逆的亲和力，分离纯化生物分子的技术，是酶分离纯化的重要技术酶分离纯化的重要技术 专一而可逆的结合包括：专一而可逆的结合包括：酶蛋白与底物、竞争性抑制物和辅助因子酶蛋白与底物、竞争性抑制物和辅助因子 酶蛋白（抗原）与抗体酶蛋白（抗原）与抗体 酶酶RNA与互补的与互补的RNA（3）亲和色谱(层析）（1）定义：利用生物分子与配基之间所61（2）原理：）原理：酶的底物或竞争性抑制剂等通过共价键与惰性载酶的底物或竞争性抑制剂等通过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体；体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体；当含酶混合物通过亲和载体时，靶酶便与底物或当含酶混合物通过亲和载体时，靶酶便与底物或竞争性抑制剂发生特异性结合，保留在柱子上，其竞争性抑制剂发生特异性结合，保留在柱子上，其它酶和杂蛋白则因它酶和杂蛋白则因“无处可依无处可依”而被洗出柱子而被洗出柱子 最后通过解吸附，将酶洗脱：最后通过解吸附，将酶洗脱：*通过加入底物与亲和载体竞争酶分子通过加入底物与亲和载体竞争酶分子 *也可改变也可改变pH或离子强度使结合的酶解吸或离子强度使结合的酶解吸（2）原理：62（3）特点）特点因其结合的专一因其结合的专一性，所以产品的性，所以产品的纯度高纯度高步骤少步骤少亲和载体的制备亲和载体的制备较难较难造价高、规模小造价高、规模小（3）特点63四、酶的结晶四、酶的结晶4-1 4-1 定义：定义：溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，是酶溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，是酶分离纯化的手段之一分离纯化的手段之一 时间可以从几小时，几天，几个月，甚至几时间可以从几小时，几天，几个月，甚至几年。年。为获得较高纯度的酶创造了条件。为获得较高纯度的酶创造了条件。为酶结构和功能的研究提供了适宜的样品；为酶结构和功能的研究提供了适宜的样品；四、酶的结晶4-1 定义：64Art or science？Art or science？651 1、盐析结晶法：、盐析结晶法：在适当的温度和在适当的温度和pHpH条件下，于接近饱和的酶条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体慢慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程的过程;多用硫酸铵，也用硫酸钠等多用硫酸铵，也用硫酸钠等4-2 4-2 结晶方法结晶方法1、盐析结晶法：4-2 结晶方法66 通过汽相扩散的方式增加盐浓度，使蛋白析出结晶。使用的试剂盒为商品化的Hampton Research Crystal Screen I&II和PEG Screen筛选试剂盒进行，分别采用悬滴法和坐滴法。SP0987SP0987、SPD0280SPD0280蛋白质的结晶蛋白质的结晶SP0987在0.2M柠檬酸锂、20%PEG3350条件晶体质量较好SPD0280在0.2M硫酸镁、20%PEG3350条件下晶体质量较好 通过汽相扩散的方式增加盐浓度，使蛋白析出结晶67 图图3 SPD0280蛋白质母体晶体蛋白质母体晶体 图图4 SPD0280蛋白质硒代晶体蛋白质硒代晶体 图图1 SP0987蛋白质母体晶体蛋白质母体晶体 图图2 SP0987蛋白质硒代晶体蛋白质硒代晶体 图3 SPD0280蛋白质母体晶体 683、需要纯化的酶的生物学性质：（equilibrium density*常用的交联剂：环氧氯丙烷原则：选取酶含量高的材料由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。改变pH、离子强度、介电常数等实现的沉淀分离：酶的底物或竞争性抑制剂等通过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体；*也可改变pH或离子强度使结合的酶解吸层析用的微孔凝胶是凝胶材料与交联剂交联聚合而成的；3-1 分离纯化方法分类主要的提取方法小结真空蒸发器、薄膜蒸发器可用动物膜、羊皮纸、火棉胶等制成。密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用3-1 分离纯化方法分类3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂2 2、有机溶剂结晶法：是在接近饱和的酶液中慢慢、有机溶剂结晶法：是在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低而析出酶加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低而析出酶晶体的过程；常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、甲晶体的过程；常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、甲醇等醇等3 3、透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定、透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐渐达到饱和态浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐渐达到饱和态而析出结晶的过程而析出结晶的过程4 4、等电点结晶法：是通过缓慢改变酶液的、等电点结晶法：是通过缓慢改变酶液的pHpH，使，使之逐渐达到其等电点，而使酶析出结晶的过程之逐渐达到其等电点，而使酶析出结晶的过程3、需要纯化的酶的生物学性质：2、有机溶剂结晶法：是在接近饱69 五、酶的浓缩与干燥五、酶的浓缩与干燥 浓缩（浓缩（concentration)concentration)与干与干燥（燥（Drying)Drying)都是酶与溶剂（通都是酶与溶剂（通常是水）分离的技术过程，是酶常是水）分离的技术过程，是酶分离纯化的一个重要环节分离纯化的一个重要环节1 1、浓缩：是从低浓度溶液中除去、浓缩：是从低浓度溶液中除去水分或其它溶剂而成为高浓度溶水分或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程液的过程 蒸发浓缩，即通过加热或减压蒸发浓缩，即通过加热或减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，得以浓缩：发，得以浓缩：真空蒸发器、薄膜蒸发器真空蒸发器、薄膜蒸发器真空蒸发器真空蒸发器薄膜蒸发器薄膜蒸发器 五、酶的浓缩与干燥 浓缩（concentratio702 2、干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分或其它溶、干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分或其它溶剂除去一部分，获得含水较少的固体物质的过程剂除去一部分，获得含水较少的固体物质的过程 干燥时，首先是从其表面蒸发，随后才是其内部干燥时，首先是从其表面蒸发，随后才是其内部的水分子扩散到表面继续蒸发。的水分子扩散到表面继续蒸发。干燥后的物质稳定性好，利于保存、运输和使用干燥后的物质稳定性好，利于保存、运输和使用 常用的方法：真空干燥常用的方法：真空干燥 冷冻干燥冷冻干燥 喷雾干燥喷雾干燥 气流干燥气流干燥 吸附干燥等吸附干燥等 获得的酶质量最高的是冷冻干燥获得的酶质量最高的是冷冻干燥2、干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分或其它溶剂除去一部分713 3、酶的保存、酶的保存 在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。在在44下，可将酶悬浮在浓硫酸铵或下，可将酶悬浮在浓硫酸铵或PEGPEG溶液中溶液中保存，保存，10 mg/ml10 mg/ml的浓酶液可加入的浓酶液可加入25%25%50%50%甘油保存甘油保存 可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用 需还原性巯基维持催化活性的酶，可与需还原性巯基维持催化活性的酶，可与1mmol.L1mmol.L-1 1EDTAEDTA和还原性巯基试剂一起在液氮中保存和还原性巯基试剂一起在液氮中保存 许多酶在冰冻状态下保存得很好许多酶在冰冻状态下保存得很好3、酶的保存721 1、防止酶变性失活：、防止酶变性失活：（1 1）低温）低温 （2 2）一般在中性）一般在中性pHpH环境操作（环境操作（pH4pH1010不稳定）不稳定）（3 3）防重金属）防重金属,有机溶剂有机溶剂,微生物及蛋白酶污染微生物及蛋白酶污染2 2、追踪酶分离每一步的总活力和比活力，评判每、追踪酶分离每一步的总活力和比活力，评判每个步骤的可行性。个步骤的可行性。6-1 6-1 酶分离纯化的基本原则酶分离纯化的基本原则六、酶纯化步骤的设计及评价六、酶纯化步骤的设计及评价1、防止酶变性失活：6-1 酶分离纯化的基本原则六、酶纯化步736-2 6-2 选择纯化方法时注意事项选择纯化方法时注意事项1 1、样品体积、酶和杂质的量、样品体积、酶和杂质的量、pHpH及离子强度及离子强度2 2、酶的物理化学性质：、酶的物理化学性质：大小、等电点、溶解度、亲水性大小、等电点、溶解度、亲水性3 3、需要纯化的酶的生物学性质：、需要纯化的酶的生物学性质：稳定性、辅助因子稳定性、辅助因子6-2 选择纯化方法时注意事项1、样品体积、酶和杂质的量、746-3 6-3 分离方法的顺序选择分离方法的顺序选择v样品量由大到小样品量由大到小v分辨率由低到高分辨率由低到高v酶的回收率由低到高酶的回收率由低到高预处理预处理-粗分粗分-细分细分-酶的制品酶的制品6-3 分离方法的顺序选择样品量由大到小预处理-粗分-细75粗分：初步纯化粗分：初步纯化细分细分1细分细分2检查纯化的进展情况检查纯化的进展情况有机溶剂、硫酸铵沉淀、有机溶剂、硫酸铵沉淀、磷酸钙分级吸附、超滤磷酸钙分级吸附、超滤等等离子交换层析、凝胶过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、聚滤层析、亲和层析、聚焦层析等焦层析等SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳、等电聚焦粗分：初步纯化细分1细分2检查纯化的进展情况有机溶剂、硫酸铵766-4 6-4 纯化步骤的定量评价纯化步骤的定量评价测定试样中酶的活力测定试样中酶的活力和蛋白质浓度和蛋白质浓度计算比活力计算比活力制作纯化表制作纯化表酶单位酶单位/mg/mg蛋白质蛋白质6-4 纯化步骤的定量评价测定试样中酶的活力计算比活力制作纯77酶活性及比活性测定酶活性及比活性测定酶的活性酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的是指酶催化化学反应的能力，其衡量的是指酶催化化学反应的能力，其衡量的是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。标准是酶促反应速度。标准是酶促反应速度。标准是酶促反应速度。酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（在规定条件下，酶促反应在单位时间（s s、minmin或或h h）内生成一定量（）内生成一定量（mgmg、gg、molmol等）的产物或等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。消耗一定数量的底物所需的酶量。酶活性测定的酶活性测定的目的：反映组织、体液或提纯溶液目的：反映组织、体液或提纯溶液目的：反映组织、体液或提纯溶液目的：反映组织、体液或提纯溶液中酶的存在与多寡（含量鉴定）。中酶的存在与多寡（含量鉴定）。中酶的存在与多寡（含量鉴定）。中酶的存在与多寡（含量鉴定）。酶活性及比活性测定酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的78国际单位国际单位(IU)(IU)在特定的条件下，每分钟催化在特定的条件下，每分钟催化1 1molmol底物底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。转化为产物所需的酶量为一个国际单位。催量单位催量单位(katal)(katal)催量催量(kat)(kat)是指在特定条件下，每秒钟是指在特定条件下，每秒钟使使molmol底物转化为产物所需的酶量。底物转化为产物所需的酶量。katkat与与IUIU的换算：的换算：1 IU=16.67101 IU=16.6710-9-9 kat kat国际单位(IU)催量单位(katal)kat与IU的换算：179=酶的比活力（酶的比活力（specific activity):specific activity):是酶纯度的是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为位为IU/mg.IU/mg.，比活力越大，酶纯度越高。，比活力越大，酶纯度越高。酶的分离纯化结果表酶液体酶液体积积（mlml）蛋白浓蛋白浓度度(mg/ml(mg/ml)单位活单位活力力(U/ml)(U/ml)总蛋白总蛋白（mg)mg)总活总活力力(U)(U)比活比活力力(U(U/mg)/mg)活性回活性回收收（%）纯化倍纯化倍数数粗酶粗酶液液粗分粗分细分细分1 1细分细分2 2酶的比活力（specific activity):是酶纯度801 1、酶的纯度（均一性）：、酶的纯度（均一性）：酶可作被研究对象，或作实验和生产用试剂，酶可作被研究对象，或作实验和生产用试剂，不同的用途，对酶的纯度要求不同：不同的用途，对酶的纯度要求不同：（1 1）作为静脉注射用酶就不能有热源；）作为静脉注射用酶就不能有热源；（2 2）作为工具酶，要求无杂酶，否则不可能有准确）作为工具酶，要求无杂酶，否则不可能有准确无误的切点，以供基因工程工作；无误的切点，以供基因工程工作；（3 3）作氨基酸顺序分析用）作氨基酸顺序分析用,构象测定构象测定,理化性质测定理化性质测定,则要求很高的均匀性。则要求很高的均匀性。一般