绿色荧光蛋白基因的克隆与表达

分子生物学综合实验论文题 目：绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达中国黄石2010 年 12 月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803 班 湖北 黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物 体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28a经过 BamH I和Not I双酶切连接后，得到pET-28a-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重 组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌 E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21,在含有1吐/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A6oo达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙 基硫代-0-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即 可。关键词： 绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆 荧光蛋白 水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein( GFP) ,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28a was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with BamH I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28a-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 yL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL 卩-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1. 前言：GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP)2. 实验试剂及实验仪器： 52.1 实验试剂与材料： 62.2 实验仪器： 73. 实验方法 73.1 质粒提取方法: 73.2 琼脂糖凝胶电泳及回收: 93.3 酶切及连接： 113.4E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入： 123.5 酶切验证重组质粒： 133.6GFP 基因的表达 143.6.1 活化菌种143.6.2扩大培养143.6.3 iPTG 诱导 GFP 基因的表达 144. 结果与分析 144.1 质粒提取过程中现象与结果： 144.2 琼脂糖凝胶电泳 154.3E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入结果：164.4 酶切验证重组质粒 164.5 GFP基因的表达结果： 175. 讨论： 185.1 提取质粒出现图六的原因是： 185.2 琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： 185.3 E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入出现图九、十原因：.195.4 酶切验证重组质粒出现图十一原因： 195.5 GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： 196. 参考文献 20前言：1.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)1.1.1 GFP 研究背景 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生 物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。日本科学家 下村修 1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母 体内含有一种生物发光蛋白质 aequori n，但它本身发蓝光，通过对光谱 的研究, 下村修提出了发光景水母所发的绿 光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白图一：夜晚水母体内GFP显色Figurel Chromogenic GFP inFellyfish at night4发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体 ， 而绿 色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的 应用， 但水母素是荧光酶的一种 ， 它需要有荧光素底物 ， 经过 酶促反应后发光。 GFP 能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我 们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色2。1987年，道格拉斯普莱沙(Douglas Prasher)克隆出了 GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁沙尔菲(Martin Chalfie)成功地通过基因重 组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生GFP，这不仅证 实了 GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法， 而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿 色革命”揭开了序幕。此后，谢尔盖路基亚诺夫(Sergey A. Lukyanov)又从一种珊瑚中分离出了 与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的 颜色。美籍华人钱永健(Roger Y Tsien)系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理,。 钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组 织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现， 为研究蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的 GFP , 都是经过改造优化了的, 而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如 图二 长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行卩折叠组成，荧 光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底 部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色 团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成2。HSVTK poly Afl oriCMV IEpUC ori4selSnaB IB4DStu(2575)Dra III(1870)ApaL(4358)AflW (1636)co01091(3852)MCS(591-665)SV40 poly ApEGFP-N34.7 kbBsrQ I (1385)A/of I (1398) Xba I*(1408)SV40ori pSV40 j e图二：GFP晶体结构Figure2 Crystal structure of GFP图三: 质粒 pEGFP-N35Figure3 pEGFP-N352001 年1 月11 日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴, 这是世界 上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这 种标志基因。1.1.2 GFP 研究应用在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为 生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不 可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞 或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观察 的细胞死亡，这叫做“光毒性”。因此，在 GFP 发现以前，科学家们只能通过荧 光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害, 分子 量小, 方便构建载体 , 同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测 , 所以, 作为一种生物分子标记, 具有广泛的应用前景 3。由于 GFP 荧光是生物细 胞的自主功能, 是一种现成的荧光蛋白质，荧光的产生不需要任何外源反应底物, 因此 GFP 作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无 法比拟的。本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N3,其结构如图三所示淇上有 所用酶的酶切位点。1.2 基因的克隆与表达基因克隆（分子克隆 molecular cloning）通过体外重组技术 ,将一段目的DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的 过程。如下图四所示:所需元件:限制性内切酶:BamH I和Not I （BamH I的切点为：5-GJGACC-3Not I 的切点为 5-GCJGGCCGC-33-CCTAGJG-53 -CGCCGGJCG-5载体:E. coLi DH5a （1.易于接纳外源DNA。2.无特异的内源性核酸内切酶3.载体复制、扩增不受阻 4.与质粒有互补性）受体细胞:E. coLi BL-21（1.易于接纳外源DNA。2.无特异的内源性核酸内切酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与载体有互补性）目的基因: pEGFP-N3选择标记基因：pET-28a（同时含有抗kana的基因有助于后面选择，和卜半乳糖 苷酶基因可被异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因GFP） 连接：平末端连接（相同酶切产生互补的粘性末端，再通过碱基互补配对连接）原核基因表达系统(Gene Expression)：由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些，所以一般将目的基因导入到原 核生物中。将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效 地表达、合成基因产物的体系。如图五所示。为提高 GFP 表达的效率，我们一般可从以下三个方面考虑：1. 基因水平上:尽量选用受体细菌细胞的偏爱性密码子62. 载体水平上:通过核外质粒构建合适的操纵子、增强子，如本实验的卩-半乳糖 苷酶操纵子基因，故通过异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的基因 GFP 表达3. 作为受体细胞上:根据DH5a和E. coLi BL-21结构特点不同，前者对外援质粒扩增阻碍作用很小，故作为克隆菌;后者易于外源基因表达，故选用表达菌。基因药表达基因克隆图五：基因克隆与表达Figure5 Gene cloning & expression 孔心女口理本实验是应用已学过的分子知识和查阅一些参考文献，来设计老师给定的实 验课题。第一，是学习运用科学理论知识指导设计实验使用方法；第二，学习科 学严谨的实验操作；第三，查阅文献了解并学习了绿色荧光蛋白基因（GFP）相 关特性和研究进展，巩固理论知识的同时也开拓了我们的视野。本实验我们做了以下工作：将绿色荧光蛋白基因（GFP）插入pET-28a构建 pET-28a- pEGFP-N3重组质粒，将重组质粒导入E. coLi DH5a扩增，用碱法提取 质粒。核酸电泳检测质粒是否成功导入大肠杆菌，再酶切鉴定所提取质粒是否为 重组质粒。将提取的质粒导入E. coLi BL-21感受态中，经IPTG诱导目的基因表 达产生绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ）本试验通过做实验过程中，王老师细心地指导及斧正以及同组同学的协商配 合，最终实验结果大抵让人满意。在表达菌E. coLi BL-21中表达了我们期望的 结果绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ）。但此试验在LB培养基平板上生长效果不是很好，酶切效果也不是那样完美，在以后的实验设计中要进 一步完善这两部分的工作。2.实验试剂及实验仪器：2.1 实验试剂与材料：1. 克隆菌株E. coLi DH5a (8311实验室提供)2. 表达菌株 EcoLi BL21(8311 实验室提供)3. LB培养基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠，溶于950 mL中， 用NaOH调节pH至7.0,补加蒸馏水至总体积为1 L，分装后高压蒸汽灭菌。(对 于固体培养基加入10-15 g琼脂粉后再加热灭菌)4. 溶液 I : 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0), 10 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCL(pH 8.0) 12.5 mL，0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 mL，葡萄糖 4.730 g，加 ddH2O 至 500 mL。在 10 Lbf/in2 高压灭菌 15 min，贮存于 4 C。5. 溶液 II： 0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL,加 ddH2O 至10 mL。使用前临时配置。6. 溶液III：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL,冰醋酸 57.5 mL， 加ddH2O至500 mL。4 C保存备用。7. TE： 10mM Tris-HCL(pH 8.0)， 1 mM EDTA(pH 8.0)。 1 M Tris-HCL(pH 8.0)1 mL，0.5 M EDTA (pH 8.0) 0.2 mL,加 ddH2O 至 100 mL。15 Lbf/in2 高压湿热 灭菌20 min, 4 C保存备用。8. 氯仿(1:1)9. 乙醇(无水乙醇、 70%乙醇)10.50xTAE： Tris 碱 54 g，硼酸 27.5 g, EDTA-Na22H2O 4.65 g，力口 ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2高压湿热灭菌20 min, 4 C保存备用。11. 溴化乙锭(EB)： 10 mg/mL12. RNase A (RNA 酶 A)：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10 mg/mL, TE 配制，沸水加热15 min,分装后贮存于-20C。13. 6xLoading buffer (上样缓冲液)：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青 FF, 40% (W/V)蔗糖水溶液。14.0.8%琼脂糖凝胶：称取0.4 g琼脂糖于三角烧瓶中，加50 mL 1xTAE，电热 套加热至完全溶化，冷却至60 C左右，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶 板中，勿使有气泡，静置冷却 30 min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电 泳缓冲液lxTAE）,即可上样。15.双酶切体系：DNA sampLe 8吐,BamHI 0.5mL （大连宝生物公司提供），Not I 0.5mL （大连宝生物公司提供）,BufferH 2 mL,Triox-100（0.1%） luL,BSA（0.1%） 1 pL, ddH2O 6 pL16.10xBuffer H： 100 mM Tris-HCL PH7.5,100 mM MgCL2,10 mM Dithiothreiol500 mM NaCL17.0.1 M CacL218.IPTG， kana 固体粉末2.2实验仪器：ORION pH计（上海公司），HD-3紫外检测仪（日本有限公司）GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）超纯水机AYJ1-0501-U （颐洋企业发展有限公司）电泳仪DYY-5 （北京市六一仪器厂）电子天平 TE412-L，TE2101-L，CP64 （德国 Satorins 公司）BS-1E振荡培养箱（江苏省金坛市亿通电子仪器厂）高压灭菌锅YXQ-LS-50S （上海博迅有限公司），手持式紫外灯 双面紫外超净工作台（苏州净化设备有限公司） ,电热套3. 实验方法3.1 质粒提取方法: 方法分别有以下几种：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA 释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱 进行处理及用加热处理。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养 细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA（有时还要求纯化质粒DNA， 根据实验所需） 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂 解后用于纯化的技术和实验要求。对于本实验要求提出大量的质粒，且为使操作 简便故选用SDS碱裂解法。其基本原理：（1）当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入 中和液后，质粒 DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋 白质与染色体 DNA 不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。（2）在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本 身的大小和构型（相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样），且DNA分子 的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不 同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分 子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没 有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用 EcoRI 来线性化质粒后再 进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样） 其具体操作步骤如下：1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20 mL LB （含KanalyL /mL）液体培养基中，37 C、200rmp振荡培养过夜（约14h）。2、取1.5mL培养液倒入1.5 mL eppendorf管中，10000rmp离心1min。弃上清， 将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。3、菌体沉淀重悬浮于200 yL溶液I中，（需剧烈振荡，使菌体分散混匀。）室温下 放置 3 min。4、加入新配制的溶液II300 yL，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以 混匀内容物（千万不要振荡），冰浴3 min。5、加入200 yL预冷的溶液III,盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状 沉淀，可在冰上放置3min。12000rmp离心3min。溶液III为中和溶液，此时质 粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使 SDS- 蛋白复合物沉淀。6、上清液500 yL移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀， 12000rmp离心10min（500 yL的苯酚/氯仿/异戊醇。）7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入 2倍体积预冷的无水乙醇，混匀， 室温放置 2-5min，离心 10000rmpx2min。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入ImL 70%乙醇洗 沉淀一次， 10000rmp 离心 10 min。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。10、将沉淀溶于20 mLTE缓冲液（pH8.0储于-20C冰箱中。）3.2 琼脂糖凝胶电泳及回收: 实验原理：琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。 其结构单元是d-半乳糖和3, 6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的 作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。影响DNA在琼脂糖 凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基 质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为 摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖 浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在 DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3） DNA的构象 超 螺旋环状（I型）、切口环状（II型）和线状（III型）DNA在琼脂糖凝胶中以不 同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流 强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，I型DNA 比III型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压 低电压时, DNA 片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移 率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。 要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电 泳缓冲液 DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电 导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10xbuffer）,电导 率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化， DNA 变性。具体操作步骤：1.1.0.8%琼脂糖凝胶的配制：精确称取0.4 g琼脂糖加到三角瓶中，加50 mLlxTAE缓冲液于三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，冷却至60 C左右，2. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架 好梳子；3. 轻轻旋转琼脂糖凝胶以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4. 室温下 45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面 1mm 为宜，如样品孔内有气 泡，应设法除去；6. 在DNA样品中加入10x体积的载样缓冲液（Loading buffer）,混匀后，用枪 将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠 近加样孔的一端为负）。一般100V电压，电泳40min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子 量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。10. 同原质粒一起琼脂糖凝胶电泳鉴定回收片段。根据亮度可以估计回收的量。11. 待回收的 DNA 段经电泳分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需 DNA 段，放在1.5 mL EP 管中；12. 加入3倍（请准确估量凝胶的体积）体积的溶胶液（以100 yL体积胶加入300 yL溶胶液为一次标准反应），室温下放置5分钟或50C保温3分钟， 其间轻摇EP管几次使胶完全融化；13. 加入10 yL玻璃奶（玻璃奶使用前请充分摇匀），颠倒混匀，冰浴下放置10 分钟。每隔23分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清；14. 加250 yL漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇=3： 7配 制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀， 12000rpm 离心 30 秒，吸弃上清；15. 重复步骤4 （尽量吸尽漂洗液）。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头 将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37C烘箱干燥直至沉淀呈白色， 约 1520 分钟；16. 加适量洗脱缓冲液即无菌水（20 yL为一次标准反应），混匀，60 C水浴5 分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤6,能提高回收率。3.3酶切及连接： 实验原理：迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照 亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识 别位点之中或临近的确定位点特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制片段， 因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamH I和Not I这样在识别 序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以 同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单 聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC ； Hind III 识另U AAGCTT;Bam HI 识另U GJGATCC; Not I 识别 GCJGGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BgL I识别GCCNNNNNGGC）。 限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：（i）两5 -G/AATTC-3条链断裂的位置 3 -CTTAA ； G-5 是交错地，产生粘性末端，如EcoR I 酶切后产生末端；（ii）两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端，如Hae III酶切后产 5 -GG ； CC-3生3 CC/GG5。DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基（-0H）,和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）。35反应体系选平衡液，依据查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在 不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的 话，就可以用这种buffer作为反应buffer。对于本实验所用的酶为BamH I和Not I在bufferH均有最高酶活性。具体操作步骤：按如下双酶切体系（30 yL）混合：反应物（yL）pEGFP-N3pET-28a质粒1818BamH I22Not I2210xbufferH330.1%BSA缓冲液331.离心10s,混匀。2.37C水浴酶切3h。3. 配制1.0% （M/V）普通琼脂糖凝胶30mL。4. 适当放置冷却，45C左右倒于电泳胶板上，插好梳子。5. 待凝胶凝固好以后,拨下梳子。6. 酶切样品中加入5 yL溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。7. 在 lxTAE Buffer，80V（3-4V/cm）下电泳 30min8. 回收连接好的目的基因，依次加入5 yL回收纯化的pET-28a质粒,GFP基因片 段12 yL，T4连接酶lyL,缓冲液（10x） 2 yL34E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入：实验原理:感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞 才能稳定摄取外来的 DNA 分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCL2 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源 DNA 的载体分子进入的感受态细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCL2 法，简便易行，且其转化效率完全 可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油于-70C保存（半年），因此CaCL2法为使用更广泛。将正在生长的大肠杆菌细胞在0C下加入到低渗的CaCL2溶液中，便会使细 胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备 感受态细胞，其转化效率可达到5x106-2x107个转化克隆子/yg超螺旋质粒DNA。 制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70 C冻存。在0C下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激(42C, 90s) 诱导细胞吸收 DNA。转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37C培养lh,可使质粒DNA 中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞 可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。 具体实验操作步骤：用枪头挑一大肠杆菌E.coLi DH5a或BL21单菌落放入2 mL LB液体培养基(含 Kana 1 yL/mL), 37 C 培养过夜。(1) 活化大肠杆菌：取4mL新鲜的LB液体培养基加入80 yL的过夜菌，培养3 个小时。(2) 将昨夜摇出来的E.coLi DH5a或BL21培养液转入离心管中，冰上放置10min, 然后于4 C下4000rpm离心5min。(3) 弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCL2溶液600yL轻轻悬浮细胞，冰上放置20 min, 4C下4000rp m离心 5min。(4) 弃去上清，加入300 yL预冷的0.1mol/L的CaCL2溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放 置5min,即成感受态细胞悬液，可-80C长期保存。(6) 取2个无菌离心管，分别加入100 yLDH5a感受态细胞悬液，第1管加5 yL 无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5 yL,轻轻摇匀，冰上放置30min。(7) 42 C水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却5min。(8) 分别向管中加入400 yL LB液体培养基，混匀后在37C振荡培养60min。(9) 从管1中取100 yL涂布于含抗生素，从管2中取100 yL涂布于含抗生素的 平板上。正面向上放置约 10分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养 皿,37 C培养14小时。3.5 酶切验证重组质粒：原理：经同种酶切后(BamH I和Not I)，重组质粒从新被切开，经琼脂糖凝胶 电泳后，在紫外分析仪下看其跑过的胶图，进行分析。实验步骤：按如下双酶切体系(20 yL)混合：提取E.coLi DH5a中的重组质粒，在下列体系下反应反应物（yL）pET-28a-pEGFP-N3质粒8BamH I5OONot I5OOlOxbufferH2OOO0.1%BSA 缓冲液3Triox-1OO(O.1%)1BSA(O.1%)1ddH2O6水浴2h后，经过琼脂糖凝胶电泳。3.6GFP 基因的表达3.6.1 活化菌种用黄色枪头蘸取表达菌E.coLi BL21种单菌落,连同枪头一起垂直放入装有2 mL 的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为lyL /mL）中。于37 C 摇床振荡培养 14 小时。3.6.2 扩大培养将试管中活化的80pL菌液接种到4 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓 度1吐/mL）培养基于37 C恒温培养箱中培养3小时。3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现， 当OD=0.8时，加的IPTG至终浓度为0.8mM时GFP的表达量达到最大4. 结果与分析4.1 质粒提取过程中现象与结果：阶段溶液I溶液II溶液III:氯仿现 象EP管中溶 液为混浊 液。EP管中出 现上层变 澄清，下层 沉淀EP管中溶 液溶液有 絮状物产 生加入氯仿 离心后溶 液分层图表六 3-1 碱法提质粒过程中的现象Figure6 sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction 结果分析:加入溶液I的作用是维持细胞渗透压，使细胞悬浮在溶液中，故呈现浑浊；加入 溶液II作用使细胞裂解，释放内涵物，内含物溶于溶液，故上层变澄清； 加入溶液III作用是时变性的质粒在酸盐环境下从新复性，但大量基因组DNA不 能复性，在 PDS 作用下产生絮状沉淀。加入氯仿破坏了蛋白质，使其变性沉淀。4.2 琼脂糖凝胶电泳如图七所示电泳结果图可以看到，第一孔道和第九孔道跑的带在紫外分析仪下, 明显跑带量少,效果不如其余七条带。中间几条带总共出现五条带如图八，条带 1 最为明亮，说明第一条带出所含的核酸物质最多。大肠杆菌中RNA的拷贝数远 大于质粒 DNA 的拷贝数，而核酸电泳分析过程的实验操作过程中没有加入 RNase降解所制样品中含有较多的RNA,所以判断该条带一定为RNA。提取的 质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的质粒 DNA 中一个螺旋由 10 个碱基组成， 当分子上有一个缺刻时，分子会立即松弛，形成开环分子。如果质粒的双链配对 处都断裂则形成线性质粒。分子量相同的情况下，可以判定：条带 2 为超螺旋 DNA，条带3为线性DNA，条带4为开环DNA，条带5可能为线性DNA，超 螺旋DNA，开环DNA中的两者或是三者缠在一起未得到分离。图七：琼脂糖凝胶电泳九条孔道电泳Figure7 All channels in Agarose Gel El ectrophoresis图八：琼脂糖凝胶电泳中间七条孔道电泳图Figure8 Seven channels amid Agarose Gel Electrophoresis4.3E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入结果：管1中取100 yL无菌水涂布于含抗生素LB平板结果如图九为：LB平板未生长 任何菌落;管2中取100 yL重组质粒涂布于含抗生素的平板上结果如图十为：生 长少量菌落;4.4 酶切验证重组质粒空白对照管1egative contrast分析：管 1 做空白对照，表明在含抗生素的培养基上无法生存任何自然条件菌落； 管 2 实验组，表明重组质粒能表达某种蛋白物质，使重组均在此环境能生存。图十：实验组管2Figure 10 Experimental group如图十一所示所有孔道，其中第七八孔道是浓度不同的 Maker 蛋白。其余九条 孔道为实验酶切的带。两条 Maker 蛋白明显可见六条带，而实验组的带型都很模糊。已知pEGFP-N3的分子量为4700bp，而pET-28a分子量为5369 bp,故在相同的构型下，pEGFP-N3应比pET-28a跑的快一些。图中所示的六条带，有上述 原理可以判断为：条带1 pEGFP-N3超螺旋DNA，条带6pET-28a开环DNA，剩 下带2、3、4、5难以准确判断，但线性pEGFP-N3肯定在环形pEGFP-N3之前, 超螺旋pET-28a也肯定在线性pET-28a之前的。图十一：酶切验证质粒Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting4.5 GFP基因的表达结果:加入 IPTG 诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图十二所示，说明目的 基因在表达菌E. coLi BL21中表达。如图十三所示在紫外光下可以观察到菌体细 胞发绿色荧光。图十二：GFP基因在表达菌内表达 FigUrei2FP gene expression inE. coLi BL21图十三： GFP 在紫外光照射下Figure13 GFP exhibites green fluorescent under ultraviolet light5.讨论：5.1 提取质粒出现图六的原因是：1. 加入溶液I的作用是制备菌悬液，加入葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌 不会快速沉积到管子的底部，所以观察到得溶液呈乳白浑浊状；2. 加入溶液II的作用是使细胞破裂，蛋白质和细胞壁沉淀，质粒溶出，NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，它使细胞膜发生了从biLayer （双层膜）结构向 miceLLe （微囊）结构的相变化导致细胞溶解，因此观察到有大量白色絮状 沉淀；3. 加入溶液III的作用是使大肠杆菌基因组DNA沉淀，SDS遇到钾离子后变 成PDS，而PDS是水不溶的，基因组DNA较长因此发生了沉淀，因此观察 溶液较为澄清；4. 氯仿为有机溶剂可以使蛋白质变性，进一步除去初提质粒中的蛋白质沉淀， 氯仿不溶于水，所以观察到分层现象5.2 琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：1. 核酸电泳图谱中凝胶的最前端条带较亮，说明该处有较多的核酸物质，而在 质粒提取分析过程的实验操作过程中没有加入 RNase 降解所制样品中含有 较多的RNA （由E. coLDH5a转录产生），所以判断该条带一定为RNA,但 是由于电泳的时间不够，导致不同大小的RNA未分开。2. 第一孔道和第九孔道条带没有其他孔道的核酸物质得多，条带不明显。分析 可能的原因是，第一孔道最先上样，而总共有九个道操作时间过长导致开始 电泳时孔道中的样品已经发生扩散，所以导致电泳时条带不明显，而第九孔 道上样是样品还未来得及在重力作用下进入孔道，电源就一接通，致使部分 质粒样品在缓冲液分子的作用下，扩散到缓冲液中，所以导致电泳时条带不 明显3. 第一孔道由于样品时间放置过长后扩散，仅仅观察 1 条带，且为条带 2，为 超螺旋型质粒，因为一般提取的超螺旋质粒占总量的70%以上，所以在样品 量较少的情况下仅可观察到超螺旋质粒条带。第九孔道由于样品还未进孔 道，在缓冲液的作用下，可观察到条带4、5，可能为环形或是混合构型的质 粒，已知相同环境下，超螺旋型质粒和环形质粒运动的阻力要小一些，故很 容易在电源接通条件下被扩散出去，所以观察到仅为条带4、55.3 E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入出现图九、十原因：管1中取100 yL无菌水涂布于含抗生素平板未长菌的原因是：抗生素kana能够抑制自然条件下一般细菌的生长,结果未长菌正好对照管2长菌是目地菌。从管 2 中取 100 yL 涂布于含抗生素的平板上长少量菌的原因可能是：1. 目地基因在表达菌EcoLi BL21中得到，故其能在抗生素kana平板上生长2. 少量菌的原因为感受态制备过程中，由于时间和温度把握不充分，一些重组质 粒未进入细胞中，故细菌未得到重组质粒，或是部分质粒被E. coLi BL21体内的 酶机制降解了，故都无法在目地菌中表达抗Kana的蛋白故无法生长。3. 在加入氯仿后，按照预计现象应该是透明的水层在上，浑浊稠密的有机层在下 方，且目的质粒在上层中。但实际操作中可能由于氯仿的比重或是溶液放置时间 过长，致使有机层密度小于水层，故质粒分布在上层有机层中。但我们组操作时 因不慎震动摇晃了。5.4 酶切验证重组质粒出现图十一原因：实验组的九条孔道跑带都不清晰的原因可能是：1. 用于酶切的重组质粒DNA含量太少或者是浓度低，所以没有maker蛋白显带那么亮。2. 电泳时间太短，致使已经酶切分离的质粒，在实验时间内还未来得及分开。3. 提取的质粒含有一些杂质，而这些杂质可以堵塞孔道，致使质粒无法在电泳 胶上顺利跑开，所以看到的质粒未分开。4. 水浴酶切反应时间不足，质粒还没在酶的作用下充分反应，故看到的重组质粒没切开。5.5 GFP 基因的表达结果如图十二、十三原因：重组质粒pET-28a-pEGFP-N3在IPTG的诱导下，GFP基因没有物种特异性，在原 核细胞中能获得了成功表达，大量表达对细胞没有毒性成功在E. coLi BL21体内 得到表达，故使E. coLi BL21呈现出黄绿光，在紫光光照射下，呈现强烈绿色。对于本次综合性实验，所运用的实验条件并没有硬搬一般文献上给定的数 据，如再进一步提纯质粒浓度时（文献中是酚氯仿7，而实验室用的是酚氯）， 离心的转速（文献是8000rpm，而试验中统一为lOOOOrpm）、而使用仅有离心机 不具有是温度保持在要求范围内)等,我们以实验室的现有条件为基础,成功的构 建出了含有绿色荧光蛋白的报告基因。实验中得到的结果，也存在与理论不一致的地方，如在加入酚氯仿之后， 应该是上层为水层，但实验观察到的下层为水层，此处为避免出错，实验中本小 组上下液层各取了一eppendorf管，并分别进行了后续试验，图七证明了结果质粒 的确在上层的有机层，而不是课本所说在上层水层。由此说明对于参考文献，我 们应该怀有一种批判的心里对待，在实验室要有严谨的科研素养，以实验为中心， 相信实验结果。6.参考文献1 吴世康. 2009. 绿色荧光蛋白质 ( GFP) 的发现、 表达和发展. 影像科学与光 化学, 27 ( 1) : 69 782 朱昀 李朝炜(河北科技大学生物科学与工程学院 石家庄) .绿色荧光蛋白 3崔志芳, 邹玉红, 季爱云. 2008 . 绿色荧光蛋白研究的三个里程碑! ! ! 2008 年 诺贝尔化学奖简介. 自然杂志, 30( 6) : 324 3284 Dr. Robert E. Campbell, University of Alberta, CANADA. Campbell (2008), Scholarpedia, 3(7):5410.5 Novagen.ORDERING 800-526-7319.TECHNICAL SUPPORT 800-207-01446 陈伟伟, 郭正红, 康升云, 魏兰珍, 王全喜. (上海师范大学 生命与环境科学学 院, 上海 200234) . 增强型绿色荧光蛋白在集胞藻 6803 中的表达魏春红、李毅现代分子生物学实验技术高等教育出版社，2006:1-44；鸣谢：很感谢指导老师王友如，给予我精辟的理论和熟谙的实践指导，是我受益匪浅！同时感谢同学宜佳，丁佐彬友好的合作帮助！