全二维气相色谱原理及特性研究.ppt

全二维气相色谱分离原理及特性研究,1.概述 2.全二维气相色谱原理及优点 3.全二维气相色谱调制器 4.全二维气相色谱分离特性研究 4.前景展望,图1 全二维气相色谱技术发展历史,1.概述,1990 年 1 月 Bushey 和Jorgensen 等最早提出用排阻色谱和反相 HPLC 实现全二维液相色谱,并首次提出了全二维色谱。5 月他们又用HPLC 和 CE 第一次实现了全二维 HPLC/CE。 1991 年 Phillips 和 Liu用他们以前在快速色谱中使用的在线热调制器发展出了一种新的二维气相色谱系统。由于采用这个系统全部的样品均被分析，而不仅仅是被中心切割的馏分，因此这个系统被命名为全二维气相色谱，以区别传统的二维气相色谱。 1997 年，Marriott 和Kinghorn 等提出了径向冷调制的全二维气相色谱，原理是通过移动的冷阱吸附和脱附组分进行调制。,1998 年，Synovec 等首次报道了采用阀调制的全二维气相色谱。 1999 年，美国 Zoex 公司开发了狭槽式热调制器并实现了全二维气相色谱的商品化。 2000 年，Zoex公司的 Ledford 等改进了狭槽式热调制器，在调制管的末端交替使用冷气和热气来对组分起捕集和脱附作用，改善了低沸点组分的调制效果，减小了峰宽。这种调制器不再使用移动部件和厚液膜调制管，直接用第二维柱的一部分作为调制管，且第一维柱长不受限制，柱系统的更换和连接更简单、方便。,2.1 全二维气相色谱原理 全二维气相色谱是把分离机理不同且互相独立的两根色谱柱以串联方式结合成的二维气相色谱，两根色谱柱由调制器连接，调制器起捕集、聚焦、再传送的作用。经第一根色谱柱分离后的每一个色谱峰，都经调制器调制后再以脉冲方式送到第二根色谱柱进一步分离。所谓全二维，意义在于此。通常第一根色谱柱使用非极性的常规高效毛细管色谱柱，采用较慢的程序升温速率（通常 1-5/min）。第二根色谱柱通常使用对极性或构型有选择性的细内径短柱。组分在第二维的保留时间非常短，一般在 1-10 s，因此第二维的分离也可近似当作恒温分离。,2.全二维气相色谱原理及优点,图2 全二维原理示意图,组分在第二维的快速分离使得到的色谱峰峰宽很窄，典型的第二维峰底宽为 100-600ms。这样窄的色谱峰需用快速检测器来采集信号构建二维谱图。全二维气相色谱谱图的生成如图 2所示，分为调制、转换和可视化三个步骤。第一根柱后流出的峰经数次调制后进入第二根色谱柱快速分离，经由检测器检测得到原始数据文件。原始的数据文件根据所用的调制周期和检测器的采集频率进行转换得到二维矩阵数据。在矩阵谱图中，不同调制周期的第二维谱图按周期数并肩排列。可视化是通过颜色、阴影或等高线图的方式将峰在二维平面上呈现出来，有时也用三维图形描述。,1D chromatogram At first column outlet,Raw 2D chromatogram At second column outlet,Second-dimension chromatograms Stacked side by side,2D colour plot,Modulation,transformation,Visualization,图3 全二维气相色谱谱图的生成和可视化,2.2 全二维气相色谱优点,（1）分辨率高、峰容量大。在一个正交的GCGC系统中，峰容量为其组成的两根柱子各自峰容量的乘积，分辨率为两根柱子各自分辨率平方加和的平方根。美国Southern Illinois 大学已成功地用此技术一次进样从煤油中分出一万多个峰。可以说，GCGC是目前最高分辨率的仪器。 （2）灵敏度高。经第一支色谱柱分离后，馏分在调制器聚焦，再以脉冲形式进样（图4），图中的这个峰被调制了6次，信号强度比调制前放大了约20倍。因此，灵敏度可比通常调制前放大了约20-50倍。,图4 调制前后谱图的变化（冷喷调制器调制周期为3s）,（3）分析时间短。由于使用了两根不同极性的柱子，因此样品更容易分开，总分析时间反而比一维色谱短。 （4）定性可靠性大大增强。两个因素对此起作用，第一，大多数目标化合物和化合物组可基线分离，减少了干扰；第二，峰被分离成容易识别的模式，同系物成员在第二维具有类似的保留值，而异构体成员则形成“瓦片状”排列，形成“结构化”谱图。,3.1调制器 在GCGC中，核心部件是安装在两柱之间的调制器，硬件开发研究主要集中在发展更可靠并易于操作的调制技术。调制器起到捕集、聚焦、再传送的作用，相当于第二维色谱柱的连续脉冲进样器。一个优良的调制器需满足的条件是: (1)能定时浓缩从第一柱流出的分析物 (2)能转移很窄的区带到第二柱的柱头，起第二维的进样器的作用 (3)聚焦和再进样的操作应是再现的，且非歧视性的。这种聚焦和再进样的过程应是可以重现的，而且对所有物质是非歧视性的。,3.全二维气相色谱仪器,A、热调制器 热调制器是在全二维气相色谱中最早出现的调制形式。调制器采用厚液膜固定相对第一维的流出物质进行捕集，采用瞬间提高温度的方法，将物质在固定相上脱附，达到再进样的目的。 Phillips等设计的最早的全二维气相色谱就是采用一个两段涂金属的毛细管，用于对柱1流出溶质的富集和富集组分的快速热脱附。尽管应用这个调制器获得了一些好的结果，但由于涂层常被烧坏或毛细管断裂，不得不经常替换。涂层的不均匀也给调制带来一定问题。,为了克服金属涂层二段调制器的缺陷，Ledford和PhillipS设计了一种基于移动加热技术的调制器（图5），它使用一个步进电机带动加热元件（“扫帚”）运动通过毛细管来达到局部加热的目的。此设计的最重要优点四：该加热器热质足够大，可提供一个稳定的很好控制的温度。,图5 狭缝式热调制器,B、冷调制器 与特调制器不同，冷调制器利用冷阱或冷喷系统进行调制，是目前最为主要的调制方式。1997年Marriott和Kinghorn发展了一种基于移动冷阱冷聚焦的调制技术称之为径向冷调制（LMCS）。调制器由移动冷阱组成，形成可以径向移动的冷捕集调制系统，这种调制器的原理如图4。,图6 径向冷调制器（LCMS)结构图,由于冷阱的作用，第一维的流出谱带以很窄的区带宽度被保留在冷阱调制器的T（Trap）位（捕集）中，每隔几秒，调制器从T位快速移动到R（Release）位（释放）。原先T位捕集区间的毛细管开始由炉子气加热，被捕集的馏分被立即释放，以很窄的区带在第二根柱的柱头进行第二次分离，同时，从第一根柱流出的馏分在释放区间（R位）被捕集，避免了与前一周期组分在第二柱的重叠。根据设定的调制时间，这个过程将重复，知道第一根柱分析结束。 这个方法的主要优点是调制器中的毛细管加热到正常的炉温即可使其脱附，与狭缝式热调制系统相比温度上不受限制，可以分析沸点更高的物质。明显缺点是：调制器部分色谱柱的固定相长期处于低达-50的物理状态。,C、阀调制器 阀调制器是有Synoves等在1998年提出来的。它的组成见图7a：采用一个六通隔膜阀作为调制器，通过快速阀切换，第一根柱后流出的样品经分流后进入第二根色谱柱，进行第二次分离。由于使用分流进样，样品的大部分被放空，只有10%-20%的馏分被送进第二根柱检测，因此检测灵敏度要比其它调制技术低得多。在2000年，Sleey等针对Synoves的阀调制技术作了改进，改进型的阀调制示意图见图7b。隔膜阀连接一个采样管，且第一维柱和第二维柱采用不同的流量。通常第二维色谱柱的柱流量是第一维的20倍。一个循环中80%的时间用于采样，20%的司机用于样品转移至第二维柱。,图7a 阀调制器结构图,图7b 阀调制器结构图,3.2 检测器,GCGC中第二维分离非常快，应在一个脉冲周期内完成第二维的分离，否则，前一脉冲的后流出组分可能会与后一脉冲的前面组分交叉或重叠，引起混乱。通常典型的第二维峰底宽度为100-600ms。峰宽主要与使用的调制器、第二维色谱柱的长度、线速等有关。由于第二维近似是恒温操作，对于给定的色谱条件来说第二维的峰宽取决于保留时间。因此，检测器的响应时间应非常快。对于峰宽很窄的色谱峰的检测需要快速检测器。快速检测器需要较小的内部体积，较短的响应时间和足够高的数据采集频率才能确保二维谱图的准确构建。现代FID检测器的内部体积几乎可以忽略不计，且采集频率高达50-200Hz，是被最广泛采用的全二维气相色谱检测器。,4.全二维气相色谱分离性能研究,4.1 引言 多维色谱的正交分离是指组成多维色谱的各维之间彼此不相关，产生的交叉信息为零。正交分离时，各维的保留彼此独立，可用的峰容量等于多维色谱的最大峰容量一即各维峰容量的乘积。全二维气相色谱是将两根分离机理不同的色谱柱以串联方式连接。在适当的色谱条件下，可消除两维保留机理相似的部分，使得二维的保留不相关，实现全二维气相色谱的正交分离。,影响气相色谱总分离效能指标(K1或R)的因素有柱效、容量因子和相对保留时间，因此气相色谱的优化涉及色谱热力学和动力学，只有在优化的色谱柱系统上才能获得真正的最佳操作条件。全二维气相色谱与一维气相色谱相似，条件的优化需要考虑柱系统、固定相、柱参数、柱温及其流速对分离的影响。但在给定的柱系统条件下，在实际样品分析中最常用的优化因素是柱温。,4.2 全二维气相色谱总分离性能指标（K1或R） 全二维气相色谱两根色谱柱以串联方式连接，第一根色谱柱为常规色谱柱，第二根色谱柱为细内径短柱以实现快速分离。通常情况下，柱温采用线性程序升温。组分在第二维的分离一般为2-10s，近似恒温条件。当两柱置于同一柱箱时，组分在第一维柱后的流出温度即为第二维的恒温分离温度。全二维气相色谱条件最佳化的目的是使得给定混合物中感兴趣组分的总分离效能指标K1遵守 K1K1req R=1.7K1,同时总的分析时间最短。其中K1req是定量分析精度要求的总分离效能指标。1DGC柱温智能最佳化是围绕最难分离物质对及其交叉点的预测展开。全二维气相色谱需综合考虑两维的分离能力。组分的总分离效能指标包括第一维的总分效能指标凡K1,1st，和第二维的总分离效能指标K1,2nd。其中第二维的总分离效能指标是针对在第一维共流出的组分，即出现在第二维相同调制周期的组分。,组分流出第一根柱子时，第一维的总分离效能指标R1st，可用下式计算:,式中W1st(i)、W1st(i-1)分别为流出峰i、i-1在第一根柱 上的峰底宽tr,1st(i) tr,1st(i-1)，其值等于(或小于)调制 周期与组分的调制周期数的乘积。,类似的第一维柱后共流出的组分进入第二根柱进行进一步的分离，在第二维同一周期的柱温近似为恒温。组分在第二维的总分离效能指标K1,2nd可用下式计算:,式中W1/2,2nd(i)、W1/2,2nd(i-1)分别为同一周期内的流 出峰i、i-1在第二根柱上的半峰宽(tr,2nd(i) tr,2nd(i-1)， 其值可由组分在第二根柱上的保留时间来计算，因其 值是相对值也可以直接取色谱工作站采集的同一周期出 峰的两个组分的保留时间来计算。,4.3 试剂和样品,图8 标准样品的GCGC谱图,4.4 结果与讨论,图中是38种标准物质的GCGC分离谱图，图中第一维根据沸点分离，最底部的一条带是C6-C15正构烷烃等间距分布，第二维根据物质的极性分离，依次是烯烃、苯系物、蔡系物的同系物成员排列成几乎平行的直线，同系物成员的二维保留值近似一常数。充分利用了两维空间，说明在适当条件下GCGC可实现正交分离。,4.4.1初始柱温对GCGC分离影响,图9 初始柱温对GCGC分离的影响,图可以看到在起始柱温25、30、40时，系列正构烷烃同系物成员在最底部的一条线上，第二维的保留时间近似为常数，可认为组分在第二维的保留与第一维无关，两维实现了正交分离。随着起始温度的增加，同系物成员在两维上的分离表现出相关性，第一维流出较晚的在第二维流出也较晚。这是由于在较高的起始温度下，两维采用相同的柱温程序，其第二维的柱温升高引起的保留值下降不足以补偿柱1流出的同系物成员挥发性的下降。此时，柱2的分离机理是部分挥发性和极性共同作用的结果，两维固定相的挥发性作用使得保留相关。,4.4.2 程序升温速率对GCGC分离影响,图10 程序升温对GCGC分离速率的影响,由图可知，程升速率对二维流出温度影响较大，随着程升速率增加一维分辨率降低，组分在二维的流出温度升高，二维保留降低，因此也降低了二维的分离度。从图中可以看出，程升速率为2/min时，一维的分辨率提高，但二维的流出温度低，组分保留长，调制周期6s，在一定程度上影响了一维的分离度。随着程升速率的提高，调制周期缩短，图c可看出程升速率为10/min，可采用25的调制周期，峰拖尾。20/min的升温速率流出温度高需要后恒，而且两维的分离很差。图中的结果表明，程升速率对分离具有较大影响。,4.4.3 载气线速对GCGC分离影响,图 11载速对GCGC分离影响,对第一维来说保持其他条件不变，增加线速会减少分析时间，流出温度降低。对第二维来说，增加线速缩短分析时间，但同时分析温度降低又使分析时间增长。第二维的保留时间变化是两者共同作用的结果。图中a，b，e，d分别对应的是第一维 线速为30cm/s、30cm/s、30cm/s和30cm/s时LCO在二维的分离。从图中可知线速变化对二维分离的影响不显著。,4.4.4 柱系统的匹配对GCGC分离的影响,图 12柱系统的选择对GCGC分离影响,图a第二维柱是中等极性的007-17柱，图b的第二维柱是极性的BTR-CW-10NB-0.1F柱，图c第二维柱是手性环糊精的cyclodex-B柱。图a和图b中组分的极性沿第二维方向逐渐递增。二环的萘分布在单环芳烃的上部，图a芳烃的同分异构体聚堆分布，而图b相同碳数的芳烃同分异构体斜线排列。图a，b正构烷烃几乎在一条线上，实现了正交分离。图c组分分布没有规律性。对于图c所用的柱系统而言，二维柱系统的分离机理均是挥发性、极性和手性共同作用，使样品中的同系物、异构体和对映异构体等被分离，平面分布没有呈现规律，不能实现正交分离的结果。只有非极性或弱极性的第一维柱配中等极性或极性的第二维柱才有可能实现GCGC的正交分离，充分利用两维空间。,4.4.5 柱参数对分离的影响,图a，b，c，d对应的第二维柱长分别为70cm，75cm，105cm和150cm的一个周期的第二维分离谱图。图中出峰依次是C11烷烃，C6取代苯，C5取代苯和萘。从图中可知当柱长由70mc增加至75cm、105cm和150cm时，调制周期由6s增加至7s，9s和11s，组分在第二维的保留时间分别增加了1.17倍，1.5倍和1.83倍。柱长为150cm时，萘的第二维保留时间为10.6s。三环芳烃化合物在第二维的保留超过了12s。对于从柱1中流出一对物质来说，第二维柱长增加其相对保留时间不变。当柱长由70cm增至105mc和150cm时，在第一维重叠的C11烷与萘在第二维的总分离效能指标K1分别为43.34，48.89和62.29，分别增加了1.13倍和1.44倍。从图中还可以看出第二维柱长由70cm增至105cm和150cm时，在十二烷与萘之间可分离峰的数目由4增加至6和12。,4.4.6 二维峰容量对分离影响,图 14峰容量对GCGC分离的影响,4.4.7 结论 为了实现二维的正交分离，在选择合适的柱系统并且柱温采用程序升温方式时，还应选择恰当的初始柱温。初始柱温过高会影响正交分离，特别对先流出的同系物成员影响较大。程升速率增加，同系物组分的流出温度同步长增加，不同的程序升温速率对正交分离影响不大。载气的线速对正交分离影响不明显，在满足分离要求时，尽量采用较高的线速。固定相的匹配对两维的分离影响很大。,改变第二维色谱柱的柱长，当柱长由70cm增加至150cm时，组分在第二维的分辨率增加了1.44倍，而保留时间增加了1.83倍。第二维保留时间的增长使得调制周期随之增长，其结果牺牲了第一维的分辨率。对于族组成分析，人们更感兴趣的是第二维的分辨率，因此可用增加第二维柱长的方法来提高组分在二维的族分离。对于未知样品的全分析，增加柱长不是改善二维分离的最好办法。,5.前景展望,从1999年起开始全二维气相色谱的研究工作。他们在油品族组成分析、中药挥发油的组成表征、卷烟烟气的组成表征、石油馏分中硫化物的组成分布、新型调制器的研制等方面开展了多项研究。全二维气相色谱作为一个近年出现的新技术，发展的历史还很短，在理论、调制器技术和应用方面还有许多工作有待开展。,