动物细胞大规模培养技术.ppt

动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和 悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式 细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流 等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中空纤维法等。 如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究 和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、 治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子 、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的 工具。 1悬浮培养技术 基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液过 滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜 培养液的培养系统中。传代时按比例稀 释即可继续培养。 对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加 人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60250um的微珠。 2微载体培养技术 理想的细胞支持物应该具备特征： (1)生物相容性 (2)简便的无毒害固定化过程。 (3)良好的传质特性。 (4)良好的机械稳定性。 (5)最大的比表面积。 (6)适合细胞生长的形状和大小。 (7)粒径分布均一。 (8)能高压灭菌。 (9)可重复利用，易于清洗。 (10)能保护细胞免受机械损伤。 (11)接种方便。 (12)能固定大部分细胞。 (13)适合大规模培养。 (14)易使细胞、载体与培养基分离。 (15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。 微载体系统培养细胞的步骤是： (1)选择合适的微载体类型 (2)浸泡水化及消毒 (3)接种 (4)培养观察与细胞记数 (5)消化 (通常用酶消化法)。 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。 (6)分离细胞： 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400rmin，2min离心加速 微载体沉淀。 (7)传代培养： 如果进行放大培养，可在细胞脱离微载 体后，加入一些新的微载体以增大培养 体积，提高培养液的利用率，不过此法 比全部用新微载体的细胞得率要少。 尽量减少培养液中Ca2+浓度可促进微载 体之间的细胞转移。 除了交联葡聚糖为基质的微载体,还可采用以 下微载体： 1)纤维纤维 素为为基质质微载载体： 2)蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋 黄色，表面特性好，易与细胞结合。 3)高分子材料为基质微载体： 4)无机玻璃基质微载体。 3 多孔载体培养 一优点 降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间 ，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量， 强化传质。 多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞 的固定化连续灌流培养。 多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损 伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未 长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单， 特别适合于反应器大规模培养。 多孔载体制备的材料选择 主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳 (1）生物相容性：材料对细胞必须无毒害， 对贴壁细胞有良好的黏附作用。 (2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下 不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用 的要求。 (3)热稳定性：在121 、蒸汽灭菌下不分解 、不破碎、不软化。 4微囊化培养技术 微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体 ，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶 、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可 包裹在其中不能逸出，利用它们催化反应底物 。微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在 微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各 自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生 长体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细 胞产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、 干扰素等生产提供了有效途径。 5 中空纤维法 中空纤维细胞培养技术是理查德克瑞 克等在1972年发明的。最初使用的空心 纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素 混合组成的可透性膜，表面有许多海绵 状多孔结构。这样，水分子、营养物质 和气体可以透过，细胞也可在上面帖附 生长。 中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生 长的三维状态，利用人工的“毛细血管”中 空纤维供给细胞生长的营养等条件。培养系统 的核心部分由3-6层这样的空心纤维组成，培养 时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。 培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血 培养基。此时虽然细胞不再增殖，但能正常生 活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法 在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产 激素和单抗时经常采用。 九 动物细胞生物反应器培养 91 生物反应器的特点分析 由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切 敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统 的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量 培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和 过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物 反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反 应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固 定床为主。 用于动物细胞与组织培养的 生物反应器应具备的基本要求： (1)混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状 态，剪切力小，保证良好的传质效果。 (2)反应器内空间利用率高，选用合适的载体系 统和材料。 (3)能严格保证无菌环境。 (4)能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和C02 浓度等条件。 (5)能够方便地实现培养液的连续添加、样品的 采样和观察。 92 生物反应器应用概况 采用生物反应器进行动物细胞培养是一种有效 的途径。但是，由于动物细胞、组织的多样性 ，使得在培养材料、培养环境等方面千差万别 ，因此，如何根据培养对象体内生存环境的特 点，开发合适的生物反应器模拟体内营养与环 境进行高效离体培养，并对培养条件、工艺等 进行优化将是重要的研究课题。 动物细胞培养用生物反应器一般有微载体 式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等， 几种新型的反应器类型特点介绍如下： (一)柱状中空纤维反应器 中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维 管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为 壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进 出口。一般讲，细胞生长在壳体部分，新鲜培 养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过， 其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部 分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧， 在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲 出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留 在壳体内而让废培养液排出。 (二)板框式中空纤维反应器 因柱状中空纤维反应器中营养供应和代 谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布 受到影响而不均匀。 人们开发出板框式中空纤维反应器。该 反应器的中心是一束中空纤维浅床，置 于两个不锈钢微孔滤板之间。 板框式中空纤维反应器 液营养 中空纤维板 三、中心灌流式反应器 四、灌流微载体生物反应器 (五)旋转壁式反应器 一般由水平放置的内外两个同心圆柱组 成。静态的内柱由半透膜构成，使气体 可以通过该膜进行交换。旋转的外柱由 非通透性材料制成。 10生物反应器动物细胞大规模培养 1.病毒疫苗 2.非抗体免疫调节剂 3.多肽生长因子 4.酶类 5.激素 6.肿瘤特异性抗原 7.单克隆抗体 8.病毒杀虫剂 注意几个问题： (一)细胞培养环境 (1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是 提高细胞密度的主要限制因素。(2)乳酸： (3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性 作用或者改变细胞代谢水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：(5)渗透压： (6)载体：可考虑采用多孔敬载体替代容易使 细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。 (二)细胞死亡与凋亡 大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是 个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细 胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少 是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是 细胞凋亡。 用基因工程方法将bcl2基因这种细胞凋亡 抑制基因导入细胞。bcl2基因的过量表达能 抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量 。 大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止” 过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。 (三) 培养基与细胞系 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。 在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物 制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分 可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目 的产物的环境中维持高密度培养。 (四)过程监控 测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期 生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终 止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析 仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估 计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收 速率估测ATP的形成；测量在线氧化还 原能力作为活细胞浓度的指标等均得以 应用。 测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废 气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般 来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞 培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出 。 用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线 蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与 反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品 的一致性。 计数法(细胞运输) 当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买， 也在国际交流，为此需要装运细胞的 方法。 一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器 ，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法 ，方便当行，是当前多采用的方法。 具体方法： 选生长状态良好的细胞，待培养近单 层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养 瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气 留量过多，运输时大气泡来回流动 对细胞有干扰 作用。 一般经45天运输对细胞活力无大影响。时间过 长,细胞活力下降。 到达后，倒出大部分培养液 ，保留维持细胞生长所需的液体量。置37摄氏度培养 ， 次日传代。 十一 动物细胞体外培养举例 肿瘤细胞的体外培养与建系过程 体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了 动物细胞体外培养的发展历史。 1952年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上 第一个细胞系子宫颈癌细胞的细胞系，并 且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细 胞转向上皮源性细胞。 肿瘤细胞培养的发展成就主要体 现在以下几个方面： (1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞 转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血 细胞源性的发展历程。 (2)在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系 的建立的发展过程。 (3)培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再到 无血清培养基三个阶段。 (4) 生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水平 ，再到酶和分子水平的发展。 原代培养物经首次传代后，能在体外 继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而 ，这并不意味着细胞能永久生长。可能 过了若干代后，由于微生物污染、细胞 分化成熟、细胞不适应外界环境等因素 影响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能 力，可分为有限细胞系与无限细胞系两 类。一般认为，如果细胞能在体外培养 超过50代，培养时间超过一年，而且细 胞的倍增时间保持稳定时，就可以认为 建系成功。 人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系为例 建系过程： (1)取材 (2)原代培养 (3)建系过程 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速 迁移和生长。2周后，可见成纤维细胞生长。8周后， 上皮细胞生长开始明显加快. 细胞在传代三次后 贴壁生长的细胞呈现上皮状 。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长, 命名为CNE-2。经生物学特性分析后确定细胞系建立 成功.