检验核医学：受体的放射配基结合分析法

受体的放射配基结合分析法受体的放射配基结合分析法 (Radioligand Binding Assay of Receptor ,RBA) 生命活动的物质基础：生理、生化反应生命活动的物质基础：生理、生化反应 生物活性物质通过受体介导发挥作用（信息生物活性物质通过受体介导发挥作用（信息传递）传递）包括：激素、神经递质、生长因子、药物、包括：激素、神经递质、生长因子、药物、毒物、抗原毒物、抗原 受体功能异常与疾病受体功能异常与疾病 受体信息传递与药物研究受体信息传递与药物研究受体研究历程受体研究历程1889 J.N.Langley :receptive substance Paul Ehrlich :receptor30年代年代 A.J.Clark: 占领学说占领学说(occupancy theory)50年代：年代：E.J.Ariens:内在活性内在活性(intrinsic activity) R.P.Stephenson:效能效能(efficacy)60年代年代 受体的受体的I-125、H-3示踪技术示踪技术70年代年代 Earl W.Sutherland：第二信使学说：第二信使学说 Lefkowitz、 Goldstein等：受体放射等：受体放射 配基结合分析技术配基结合分析技术 分离配基受体复合物分离配基受体复合物放射配基放射配基 + + 受体分子受体分子测定受体数量和亲和力测定受体数量和亲和力定性定性RBA 通过配基与受体反应的量效关系及某些通过配基与受体反应的量效关系及某些参数的变化等来判断受体的类型，单位参数的变化等来判断受体的类型，单位点或多位点系统点或多位点系统, ,受体与配基相互作用的受体与配基相互作用的特点特点 ( (可逆或不可逆，合作作用可逆或不可逆，合作作用) )。定量定量RBA在已知配基与受体反应性质的基础上，通在已知配基与受体反应性质的基础上，通过结合反应给出一定组织或细胞中能与过结合反应给出一定组织或细胞中能与该放射配基结合的受体数称结合位点数该放射配基结合的受体数称结合位点数(number of binding sites)一一 RBA的有关基本慨念的有关基本慨念 受体受体(receptor,R) 存在于机体靶组织细胞上能与激素或药物，存在于机体靶组织细胞上能与激素或药物， 生理介质生理介质 等特异结合从而引起整个生物效等特异结合从而引起整个生物效应的特定的接受点应的特定的接受点( (结合位点结合位点) )。 配基配基(ligand,L)能与受体特异结合能与受体特异结合( (即具高亲和力即具高亲和力) )的的化学物质统称为配基。化学物质统称为配基。 激动剂激动剂 拮抗剂拮抗剂 内源性配基内源性配基 受体与配基的结合反应受体与配基的结合反应 简单单位点系统：受体与配基结合的简单单位点系统：受体与配基结合的 系统中只存在一种结合位点，即各个系统中只存在一种结合位点，即各个 受体分子表现出完全相同的结合特性受体分子表现出完全相同的结合特性 和生物效应，而且配基和受体分子以和生物效应，而且配基和受体分子以 ：的关系结合，各受体分子间不表：的关系结合，各受体分子间不表 现明显的正或负合作现明显的正或负合作 受受体体与与配配基基结结合合反反应应的的主主要要特特点点 可可饱饱和和性性( (S Sa at tu ur ra ab bi il li it ty y) ) 可可逆逆性性( (R Re ev ve er rs si ib bi il li it ty y) ) 特特异异性性( (S Sp pe ec ci if fi it ty y) ) 与与生生理理效效应应一一致致性性 fmol/ml B TB SB NSB LTnmol/L 饱和曲线 00.0010.0020.0030.0040.0050.00600.10.20.30.40.50.60.70.8配基浓度(nmol/L)复合物浓度(nmol/L)RT=0.005nmol/LKD=0.05nmol/LKD=0.20nmol/LKD=0.10nmol/L渐近线 R RT T- -R RL L L L R RT T- -R RL L L LT T- -R RL L K KD D = = = - - - - - - - - - - - = = = - - - - - - - - - - - - - - - - R RL L R RL L S SB B/ /F F S Sl lo op pe e= =- -1 1/ /K Kd d B Bm ma ax x S SB B f fm mo ol l/ /m ml l S Sc ca at tc ch ha ar rd d 作作 图图受受体体最最大大结结合合容容量量的的表表示示方方式式 胞胞浆浆及及胞胞膜膜等等的的受受体体含含量量: : f fm mo ol l/ /m mg g蛋蛋白白 胞胞核核的的受受体体含含量量: : f fm mo ol l/ /m mg gD DN NA A 完完整整细细胞胞受受体体的的含含量量: : 结结合合位位点点/ /细细胞胞( (s si it te e/ /c ce el ll l) )或或f fm mo ol l/ /1 10 06 6c ce el ll l三三、R RB BA A的的基基本本方方法法 制制备备待待测测受受体体的的离离体体标标本本 加加放放射射配配基基温温育育，反反应应达达到到平平衡衡 终终止止反反应应，分分离离结结合合与与游游离离部部分分 测测定定结结合合部部分分的的放放射射性性强强度度 数数据据处处分分理理，求求出出有有关关参参数数 待待测测受受体体标标本本的的制制备备 组组织织切切片片 完完整整细细胞胞悬悬液液 初初步步分分离离的的细细胞胞组组分分 增增溶溶或或纯纯化化的的受受体体蛋蛋白白 600 6003500g3500g 5 510 min10 min 10000 1000027000g27000g 15 1530 min30 min 100000g100000g 60 min60 min 差速离心法分离细胞组分的示意图差速离心法分离细胞组分的示意图组织匀浆组织匀浆沉淀沉淀: :胞核胞核上清液上清液沉淀沉淀: :膜受体膜受体上清液上清液沉淀沉淀: :微粒体微粒体上清液上清液: :浆受体浆受体( (可溶性蛋白可溶性蛋白) )2. 2. 受体与配基的结合反应受体与配基的结合反应饱和曲线饱和曲线 将待测的标本与标记配基在一定的条件将待测的标本与标记配基在一定的条件下进行结合反应。标记配基的浓度从低下进行结合反应。标记配基的浓度从低浓度到饱和浓度具多个实验点；以标记浓度到饱和浓度具多个实验点；以标记配基的浓度为横坐标，复合物的量为纵配基的浓度为横坐标，复合物的量为纵坐标即成饱和曲线。通过饱和曲线，可坐标即成饱和曲线。通过饱和曲线，可以求出以求出KDKD及及BmaxBmax值。值。 fmol/ml B TB SB NSB LTnmol/L 饱 和 曲 线 S S B B / / F F S S l l o o p p e e = = - - 1 1 / / K K D D B B m m a a x x S S B B f f m m o o l l / / m m l l S S c c a a t t c c h h a a r r d d 作作 图图 两种实验方案：多点法两种实验方案：多点法( (饱和曲线饱和曲线) )、单点法、单点法 两种实验方案的比较两种实验方案的比较 放射配基浓度放射配基浓度 优点优点 缺点缺点 用途用途单点法单点法 单个饱和浓度单个饱和浓度 操作简单操作简单 只能求出只能求出Bmax Bmax 临床检验临床检验 样本量少样本量少 误差稍大误差稍大( (偏小偏小) ) 药物筛选药物筛选多点法多点法 从低到饱和浓从低到饱和浓 可以求出可以求出Kd Kd 操作繁琐操作繁琐, ,工作工作 受体理论研究受体理论研究 度度(7(71010个点个点) Bmax,) Bmax,可信度高可信度高 量大量大, ,样本量大样本量大 检验反应性质检验反应性质标记配基的选择标记配基的选择 常选择与受体结合亲和力和特异性特别高的常选择与受体结合亲和力和特异性特别高的标记配基，而不一定是受体的生理激动剂标记配基，而不一定是受体的生理激动剂要求：要求： 性质性质:与受体结合具高亲和力，高特异性与受体结合具高亲和力，高特异性 比活度比活度 大于大于30Ci/mmol(1.2TBq/mmol)放放 化纯化纯度大于度大于95% 具化学稳定性具化学稳定性 3 3H-EH-E2 2纯化前后对纯化前后对NSBNSB的影响的影响(DPM)(DPM)纯度纯度(%) (%) 浓浓 度度(nmol/L)(nmol/L) 0.4 1.0 2.1 3.7 0.4 1.0 2.1 3.7 85.4(85.4(纯化前纯化前) 512 1214 2708 4043) 512 1214 2708 404398.3(98.3(纯化后纯化后) 374 827 2093 2836) 374 827 2093 2836 非标记配基的选择非标记配基的选择 性质性质 与标记配基不一定属同一化合物，但必须两与标记配基不一定属同一化合物，但必须两 者能竞争同一受体，并且非标记配基与受体者能竞争同一受体，并且非标记配基与受体 的特异性亲和力应尽可能高，的特异性亲和力应尽可能高， 浓度浓度 非标记配基在反应系统中的浓度非标记配基在反应系统中的浓度 应达到标应达到标 记配基浓度的倍以上记配基浓度的倍以上 (1002500)， 使绝大多数受体都被它占领而不再与标记配使绝大多数受体都被它占领而不再与标记配 基结合基结合 5 50 0 1 10 00 0 1 10 00 00 0 1 10 00 00 00 0 非非标标记记配配基基浓浓度度( (倍倍数数)标本采集、保存及处理方法标本采集、保存及处理方法 一标本为兔子宫内膜，用一标本为兔子宫内膜，用3 3H-EH-E2 2测定胞浆中的含量。新鲜标本的测定胞浆中的含量。新鲜标本的含量为含量为51.3951.395.57fmol/mg5.57fmol/mg蛋白。蛋白。 标本保存温度及时间对标本保存温度及时间对BmaxBmax的影响的影响(fmol/mg(fmol/mg蛋白蛋白) ) 保存方式保存方式 1 w 2 w 3 w 4w1 w 2 w 3 w 4w 液液 氮氮 48.3248.325.12 46.375.12 46.372.10 40.082.10 40.083.27 34.153.27 34.156.136.13-40 46.10-40 46.104.33 34.584.33 34.584.29 25.594.29 25.595.40 21.035.40 21.033.913.91 反应条件的选择 温育温度及时间：温育温度及时间： 3 37 7 1 1. .0 0 1 1. .0 0 4 4 2 25 50 0. .5 5 0 0. .5 5 2 25 5 4 4 3 37 7 3 30 0 6 60 0 m mi in n 3 30 0 6 60 0 m mi in n 结结合合的的时时间间曲曲线线 解解离离的的时时间间曲曲线线 反反应应系系统统的的p pH H值值、离离子子强强度度 S SB B% % 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1 10 0 p pH H对对1 12 25 5I I胰胰岛岛素素与与胰胰岛岛素素受受体体结结合合反反应应的的影影响响3.分离方法分离方法 目的目的 分离方法的要求分离方法的要求 低低NSB、有效性、快速、有效性、快速 常用分离方法常用分离方法 DCC法、离心法、过滤法法、离心法、过滤法法法( (葡聚糖包裹活性碳吸附法葡聚糖包裹活性碳吸附法（Dextran-Coated Charcoal DCC)Dextran-Coated Charcoal DCC) 基本原理：基本原理：在悬液中在悬液中 ，活性碳被葡聚糖包裹，形，活性碳被葡聚糖包裹，形成起着分子筛，未结合的、小分子的游离配成起着分子筛，未结合的、小分子的游离配基基( () )进入并被吸附，而结合的大分子复合进入并被吸附，而结合的大分子复合物物( () )则不能进入而被排斥在外，经过离心，则不能进入而被排斥在外，经过离心，复合物从上清液中获得。复合物从上清液中获得。离心法离心法方法：将达到平衡后的反应液通过离心，将方法：将达到平衡后的反应液通过离心，将留于上清液中的游离配基倾去，经反复离心留于上清液中的游离配基倾去，经反复离心洗涤次后，便可达到分离的目的。洗涤次后，便可达到分离的目的。过滤法过滤法方法：将反应液滴于玻璃纤维滤膜上，在持方法：将反应液滴于玻璃纤维滤膜上，在持续负压下抽滤。同时用不含配基的冷冻缓冲续负压下抽滤。同时用不含配基的冷冻缓冲液淋洗滤膜次，即可以将游离标记配液淋洗滤膜次，即可以将游离标记配基除去。整个抽滤过程应在基除去。整个抽滤过程应在的条件的条件下完成，并在分配时间内完成，以免受体下完成，并在分配时间内完成，以免受体配基复合物解离。配基复合物解离。2/1116tts)L/mol(71093.6s)L/mol(10/693.01k2kKD2/1t分离过程中最大的容许时间为分离过程中最大的容许时间为0.15t0.15t1/21/2。因。因此确定分离时间，主要取决于其平衡解离此确定分离时间，主要取决于其平衡解离常数常数KDKD值值 分离时间的确定分离时间的确定 4 4 . . 数数 据据 处处 理理 目目 的的 单单 点点 法法 数数 据据 处处 理理 S S B B = = T T B B - - N N S S B B 饱饱 和和 法法 数数 据据 处处 理理 S S c c a a t t c c h h a a r r d d 作作 图图 KDSBKDBFSB max W W o o o o f f 作作 图图 maxmaxBFBKDSBF L L i i n n e e w w e e a a v v e e r r - - B B u u r r k k 作作 图图 FBKDBSB1maxmax11 H H i i l l l l 作作 图图 （ L L o o g g i i t t 作作 图图 ） 0.000.050.100.150.200.250123RL (nmol/L)B/FRT1KDRT KDScatchard 作图作图 KDSBKDmaxBFSB00. 10. 20. 3-10123L (nm ol / L)F/ BKD/ RT-KDWoof 作图作图 maxmaxBFBKDSBF 010203040- 1- 0. 500. 511. 522. 51/ L (L/ nm ol )1/RL (L/nm ol )1/ R T-1/ KDLineweaver-Burk作图作图 FBKDBSB1maxmax11 - 4- 3- 2- 1012340246810Log LLog RL/ (RT-RL)n = 2n = 1n = 0. 5系统亲和力不一致系统亲和力不一致Hill作图（作图（Logit作图）作图） RL RTRL LogLnLogKDRLRTRLLog