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质粒DNA的提取,纯化及验证陈倩倩 学号:118627140313一,实验目的:1,掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2,掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。二,实验原理:碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分解和纯化质粒DNA。在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达120的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。当用pH值46的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。三,实验仪器试剂和材料:恒温振荡培养箱, 高温冷冻离心机,漩涡振荡器,水浴锅,1.5ml离心管,不同型号吸头,微量移液管等菌体:E.coli DH5受体菌试剂:LB培养基,氨苄青霉素,溶液,溶液,溶液,RNase A母液,TE缓冲液,饱和酚,氯仿/异戊醇混合液,酚/氯仿/异戊醇混合液,预冷无水乙醇,TAE电泳缓冲液,上样缓冲液。四,实验步骤及现象 准备灭菌1 LB培养基20ml/100ml ,50ml/300ml,2 枪尖:1000l,200l,20l3 离心管1.5ml/500ml,50ml24 吸管:10ml 质粒的提取。步骤备注1,E.coli DH5Puc19在20ml培养基中培养过夜,转接到50ml培养基37 度培养四到五小时,7000rpm离心五分钟,称量空管重量。1,溶液装入离心管时,要使液面离管顶至少1cm2,在接菌时,将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触,然后轻轻摇动三角瓶,让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体,当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时,接菌成功,再轻轻震荡三角瓶,使全部菌体进入培养基中空管质量为13.877g2,弃上清,加5ml溶液,打散菌泥洗涤,再离心干燥,称重。加入溶液后,将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡,无白色菌体块状物悬浮在液体中,即已振荡均匀。称重后其菌泥质量不足200mg,按200mg计算3,每100mg菌泥加溶液1ml打散混匀,冰溶5min1,避免破壁后的的染色体断裂,并且此时出现粘稠透明的胶状物2,冰浴的目的即为降低酶的活性,防止酶将质粒DNA降解。4,按量加入溶液2ml,轻加轻摇混匀。溶液为强碱性溶液,目的是使细胞破裂,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂。在加溶液时,要逐滴缓慢加入,边加边轻轻摇动离心管,此时,可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状。5,按量加入溶液1.5ml,轻加轻摇,冰浴十分钟。溶液为高盐溶液,调节碱性溶液至中性,使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。6,12000rpm离心15min,上清液轻轻转入新管,再加入十分之一3mol/lNaAc,混匀。由于DNA带负电荷,加入NaAc的作用就是是中和DNA所带的负电荷,使DNA之间的排斥力减小,有助于DNA的沉淀7,加入两倍体积冰无水乙醇,混匀。零下20度沉淀无水乙醇的作用是沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂8,12000rpm离心15min,弃上清加入3ml70%乙醇,不打散沉淀洗涤一遍70乙醇的作用一方面是继续沉淀DNA,另一方面可以除去上一步骤中溶解在溶液中的盐离子 9,12000rpm离心5min注意沉淀位置弃上清,干燥,加入1mlTE溶解。用记号笔在沉淀周围做好记号 质粒纯化加入RNaseA使其终浓度为50微克每毫升,37度0.5至1h,平分为两个小管。RNA酶分解掉RNA1, 加等体积的Tris饱和苯酚溶液混匀7000rmp离心15min,上清液转入新管。苯酚具有强氧化性,在此步骤中是使蛋白质变性,从而使蛋白质沉淀下来2, 加等体积的苯酚:氯仿(1:1)混匀7000rmp离心15min,上清液转入新管。其中是24:1的氯仿和异戊醇,异戊醇的作用有消泡,以及其自身的颜色利于分相,此步骤用于抽提酚和酯以及去蛋白3, 加等体积的氯仿混匀7000rmp离心15min,上清液转入新管。确保酚被抽提干净,此三个步骤,可以根据具体情况适当重复,省简。4, 12000rpm离心15min,上清液轻轻转入新管,再加入十分之一3mol/lNaAc,混匀。5, 加入两倍体积冰无水乙醇,混匀。零下20度沉淀0.5h以上6, 12000rpm离心15min,弃上清加入300微升70%乙醇,不打散沉淀洗涤一遍7, 12000rpm离心5min注意沉淀位置弃上清,干燥,加入100微升TE溶解至一个管。先在其中一个管中加入50微升TE然后带起溶解倒入另一管,用剩下的50微升TE洗涤第一管,再倒入另一管。 质粒检测用0.9%的琼脂糖电泳检测:1, 称重0.28g琼脂糖,用40ml1TAE微波炉加热,制平板2, 取三微升质检样品与1微升电泳载样液混匀点样电泳1hPuc19电泳结果实验点样电泳结果3, 加入溴化乙锭染色10min凝胶成像仪观察记录结果。五,实验结果及分析RNA条带或开环质粒DNA或DNA断片染色体DNA条带Puc19超螺旋质粒DNA hindDNA/ Hind Marker一, 我们组的实验结果所得的质粒DNA纯度还算理想。本实验电泳条带清晰:染色体DNA的含量很低,说明提取样品的纯度较高;没有开环的DNA,可能与过程中振荡的剧烈程度,保温时间有一定关系。但是仍有不足之处,蛋白质杂质含量较多,其原因较多,一个是由于我们未用平衡酚去除蛋白质,而是使用了酚、氯仿、异戊醇的混合液,致使蛋白质残留较多。另外,电泳条带中参照物的条带只有六条,少了两条,可能是由于电泳我们组一共跑出三条带,分别为DNA,超螺旋Puc19质粒DNA,RNA。二, 超螺旋状态的pUC19质粒,书上查得其质粒大小2.69Kbp,与标准的对比由亮度可知,我们提取的量大体上还不错。三, 对于出现RNA条带可能的原因是RNase处理时间不够,而如果是开环的DNA或染色体DNA断片则可能是震荡过激烈。四, 而对于染色体DNA 的条带亮度比较暗淡来说,我们组分离掉的染色体还很成功。五, 点样处有亮带,说明有杂质蛋白质的存在六,注意事项一, 酚具有腐蚀性,能损伤皮肤和衣物,使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚,应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。二, 注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品,避免挤出的空气将样品冲出样品孔。三, 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料,可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间,并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光,所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上,实验结束后用水彻底冲洗干净。四, 沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇,在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外,还可使用06倍体积的异丙醇,但异丙醇也能将盐等杂质沉淀,所以沉淀需要在常温下进行,并且时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后,需用70乙醇洗涤,以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。
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