资源描述
葵花宝典致亲爱的师弟师妹:本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境,师姐在这里把自己所学和资源略写一二。1、 来到实验室,无论你喜欢不喜欢,乐不乐意,一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住,以及实验室里有什么仪器!2、 关于实验部分1、 组织蛋白提取:方法一:(1)4下,先生理盐水洗,再加入蛋白提取液,剪刀剪碎,匀质器6000,循环六次,每次都拿下来冰镇,防止蛋白变性,最后14000转,20min,4(2) 跑western之前,需测BCA,以保证每个组分上样的蛋白总质量一样(此处为定量实验,看目标蛋白的表达量,若仅仅定性则无需做BCA)注意事项:匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里,先加玻璃球一般,目测大概三四毫米高度就行(包括管底小尖尖),且溶液必须装满才振荡效果好,因此,加入细胞裂解液多,容易导致蛋白浓度低。方法二:(1) 取冰(东边实验室,最后面有制冰机)(2) 将软骨从80冰箱取出,置于冰面上解冻(3) 去细胞室的液氮罐里,取出少量液氮置于泡沫箱内,(4) 转移至实验室内,取出少量,倒入研钵中,研磨(5) 浆糊状,立即转入EP管中,(6)细胞裂解液,2、western blotting(1)抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下. 2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学,负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了(2)-actin(内参蛋白) 分子质量为43KD,因此,目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致,内参也叫看家基因,在组织或细胞中都会表达,且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的,一般有-ACTIN,GAPDH等。其作用有二:(1)、 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候,内参照蛋白有条带,而目的蛋白没有,说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题,是目标蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。(2)、是比较客观的说明目标蛋白的表达情况,消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别,可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照,比较不同标本之间的表达情况。因此, 最好测一下蛋白浓度再上样,这样好点。当然也看你的实验室是定性还是定量了,定性的话,我觉得可以不用测浓度;要是准备定量,还是尽量保证上样量一致吧。 (3)5倍的上样缓冲液:用样品稀释上样缓冲液至1倍,煮沸5min,离心2min(使粘壁蛋白脱落至底部),可以放于-20隔夜保存(4)清洗工具:玻璃板,盖玻片,大烧杯和小烧杯,梳子,铸造支架,(5)根据试剂盒配分离胶。AP(10%过硫酸铵)和TEMED最后加,先混匀之前的溶液(6)沿着玻璃槽边,注胶,不要有气泡,用水封胶,30min(7)配浓缩胶,同(5)SDS是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。TEMED:通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 (8)倒掉水,用滤纸片吸干,注胶,插上梳子,避免有气泡,30min(9)安装至电泳槽,拔下梳子,加入电泳缓冲液(需要自己配,可查百度知道配方),没过玻璃板(10)上样 1.5 mm 上样量最多可为35微升,0.75mm 上样量最多为20微升红色为正极,黑色为负极。80v 30min, 上样线压平后,120V 2h1.5h 或 200V 1h电泳缓冲液配方:(11)拆开电泳槽,将凝胶放在ph=9.15缓冲溶液。(12)裁剪略大于凝胶的滤纸片六张,两张滤纸片置于PH=9.15缓冲溶液中,其余放于ph=5.19缓冲溶液中。(13)裁剪PVDF膜一张,置于甲醇溶液1min(活化PVDF,使膜表面带正电荷),再置于蒸馏水2min,摇床一会,再置于PH=9.15缓冲溶液中(14)转膜:先铺两张滤纸(ph=9.15),再铺凝胶(靠近负极),再铺PVDF膜(靠近正极),再铺四张滤纸(ph=5.19),记得润湿电转仪的上下面板Buffer 1(PH=9.4)配方:Tris 3.03g 甘氨酸 5.25g 甲醇 200ml 去离子水 1L(15)膜的面积*4.5=转膜电压,40min 200mA,20min? 100mA 目标蛋白多大,就多久转膜效果不太好,时间不够(16)最好用TBST清洗转膜液,再用5%脱脂牛奶( 5g脱脂牛奶粉末,100ml PBST (500ml 1*PBS + 1ml Tween-20,调pH 7.0-7.2,即为PBST) )中浸泡PVDF膜,1小时10*TBS tris 12.1g NaCl 88g 去离子水 1L 浓盐酸调PH至8.0如果配置1000ml的TBST: 先称量NaCl 40g ,倒入烧杯中,加DDW蒸馏水400ml,再称量NaCl 47.6g,倒入刚才的那个烧杯中,:由于NaCl的量太多,一次称量不方便,所以分两次称量,且易于溶解)。往烧杯中加入TrisHCl缓冲液100ml,最后加吐温20, 5ml,转入1000ml容量瓶中,在定容,转移即可。 (17)加一抗(5%脱脂牛奶稀释)孵育过夜,4(18)PBST洗三次,每次5min(19)加二抗(5%脱脂牛奶稀释)摇床,室温孵育,一小时(夏天半个小时)(20)PBST洗四次,每次5min(20)显色(全称避光操作):配制ECL溶液, 1.5ml左右(一张PVDF膜),显色2min(21)凝胶成像仪分析2、 细胞蛋白:可直接加入蛋白提取液,浸泡30min3、 固绿-番红O染色:固绿染色剂极易上色,20s 即可,无论你购买的哪个牌子。番红O染色剂极难上色,染色时间为25min(索莱宝),效果仍不太理想。番红O染色剂,两个小时,不理想(染色过程中,切勿放在通风橱中,染色剂会变干)4、匀质机:需要特定的管子,装样之前先要加入大概1ml的玻璃球,样品装得越满越好5、超声波细胞破碎仪:大探头,样品体积最少要20ml三、电脑装备Endnote分类文献管理,方便你写文章插入引用Photoshop一定要自学,便于论文修图作图亿图可以用来合并图片材料、添加线箭头啥的、制图Chemdraw画分子结构
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