2018-2019学年高中生物 专题5 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段教学案（含解析）新人教版选修1 .doc

多聚酶链式反应扩增DNA片段1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。2PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。3PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。5DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。一、PCR技术的原理1细胞内DNA复制的条件填表原料4种脱氧核苷酸模板2条DNA的母链酶解旋酶和DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸2PCR扩增的原理及条件(1)概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。(2)原理：子链的合成：DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物，DNA合成的方向总是从子链的5端向3端延伸。双螺旋的打开：DNA的热变性原理，即：。(3)条件：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、一定的缓冲溶液以及能自动调控温度的设备。二、PCR的反应过程三、PCR技术的实验操作1实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。2注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。四、DNA含量的测定1原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。2计算公式DNA含量(g/mL)50(260_nm的读数)稀释倍数。1PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的()A特异性B稳定性C热变性 D多样性解析：选CDNA分子在80100 的温度范围内变性，双链解开成单链；当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。2标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A92 、55 、72 B72 、55 、92 C55 、92 、72 D80 、55 、72 解析：选A当温度上升到90 以上(9096 )时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 左右(7075 )时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。3PCR实验中用到微量离心管、缓冲液和蒸馏水，使用前必须进行的关键步骤是()A反复洗涤 B用酒精擦洗C高压灭菌 D在20 保存解析：选C在PCR实验中，为了避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。同时也不能忽视其他操作步骤，如缓冲液和酶应该分装成小份，并且在20 保存。1生物体内的DNA复制与PCR反应的比较体内DNA复制PCR反应不同点解旋在解旋酶的作用下，边解旋边复制加热至90 以上时，双链全部解开酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)引物一小段RNARNA或单链DNA分子片段合成子链一条子链连续合成，另一条子链不连续合成两条子链都是连续合成温度体内温和条件高温相同点都需提供DNA复制的模板 都需要四种脱氧核苷酸原料都需要分别与两条模板链相结合的两种引物子链延伸的方向都是从5端到3端2PCR的反应过程 (1)变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链，如图。(2)复性：当系统温度下降至50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如图。(3)延伸：当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图。3PCR反应的结果从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数形式扩增。题组冲关1PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制ABC D解析：选CPCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为2030个核苷酸；PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。2在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA。PCR技术可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图，图中黑色长条是引物)。在很短的时间内将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)PCR需要模板DNA、引物、_和_等条件，其中的引物实质上是一种_。(2)图中的变性、延伸分别是指_。(3)某样品DNA分子中共含3 000个碱基对，碱基数量满足：(AT)/(GC)1/2，若经5次循环，至少需要向试管中加入_个腺嘌呤脱氧核苷酸。(不考虑引物所对应的片段)(4)若下图为第一轮循环产生的产物。请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。解析：(1)PCR技术中除需要模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸外，还需要耐热的DNA聚合酶等条件，其中的引物是一种单链DNA分子或RNA分子。(2)变性的实质是DNA双链解旋形成单链；延伸是以DNA单链为模板，按碱基互补配对原则合成子链的过程。(3)由(AT)/(GC)1/2可知ATGC1122，所以A的比例为1/6，在一个DNA分子中的数量为3 0002(1/6)1 000(个)，5次循环形成的DNA数为32个，所以需要利用原料合成的DNA数相当于32131(个)，至少需腺嘌呤脱氧核苷酸数为311 00031 000(个)。(4)画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。答案：(1)四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶单链DNA分子或RNA分子(2)模板DNA双链解旋形成单链在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链(3)31 000(4)如图1实验操作步骤2DNA含量的测定DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：注：计算公式中的50代表在波长为260 nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50 g/mL。题组冲关3使用PCR仪的具体实验操作顺序应为()设计好PCR循环程序按配方准备好各组分用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心，使反应物集中在离心管底部ABC D解析：选CPCR反应的操作步骤一般分为准备(包括将配方所需各组分放于实验台上)移液混合离心反应。因PCR仪是一种能自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。4下列有关PCR操作过程的叙述，错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换解析：选C为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。随堂基础巩固1PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，下列说法错误的是()APCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步BPCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性C延伸的温度大于复性的温度，而小于变性的温度DPCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等解析：选BPCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶。2DNA的复制需要引物，其主要原因是()A可加快DNA的复制速度B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C引物的5端有助于DNA聚合酶延伸DNA链DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链解析：选DDNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3符合PCR反应条件的一项是()稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸Taq DNA聚合酶DNA解旋酶限制性核酸内切酶温控设备ABC D解析：选DPCR反应模拟生物细胞内DNA复制的条件，只是不需要解旋酶，也不需要基因工程的工具酶(限制性核酸内切酶)。4PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是()95 使DNA分子变性，失去生物活性95 使DNA分子变性，解开螺旋55 使DNA分子开始复制、延伸55 使DNA分子的两条单链分别与两种引物相结合72 使DNA分子开始复制、延伸72 使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性A BC D解析：选CPCR技术在温度上升到90 以上时，双链DNA解旋变为单链；当系统温度下降到50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当系统温度上升到72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。5如图表示PCR扩增的产物，请分析它是哪次循环的产物()A第一次循环 B第二次循环C第三次循环 D第四次循环解析：选A在PCR反应中以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每个子代DNA中只有一种引物。从第二次循环开始，第一次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，形成的DNA分子中，只有两个仅一端含有引物，其他DNA分子两端都含有引物。6如图所示为DNA变性和复性示意图，相关说法正确的是()A向左的过程为加热(80100 )变性的过程B向右的过程是DNA双链迅速制冷复性C变性与在生物体内解旋过程的实质相同D图中左侧DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3端解析：选CDNA体外的变性和体内的解旋，其实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内解旋需要解旋酶，体外变性需高温条件。7PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如下图所示：注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物约含20个脱氧核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。(1)PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度上，在PCR中先用95 高温处理的目的是_；而这一过程在细胞内是通过_实现的。(2)DNA子链复制的方向是_，这是由于_。(3)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种_。若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入_个引物。(4)假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要_个游离脱氧核苷酸。解析：在PCR中先用95 高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，两条链解开，使DNA分子解旋，形成单链。引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3端结合，为DNA聚合酶提供结合位点，使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从子链的5端到3端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，若将1个DNA分子复制10次，则需要的引物为22102(2112)个。扩增3次一共形成8个子代DNA片段，需游离的脱氧核苷酸数为(81)4002 800个。答案：(1)使DNA变性(或使DNA的两条链解开)解旋酶(2)从5端到3端DNA聚合酶只能从引物的3端连接单个脱氧核苷酸分子(3)单链DNA或RNA分子2112(4)2 800课时跟踪检测一、选择题1关于PCR的说法，错误的是()APCR是体外复制DNA的技术BPCR过程中只需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料CTaq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶DPCR利用的是DNA双链复制原理解析：选BPCR技术是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术；PCR过程除需要DNA分子双链作为模板、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料外，还需要酶等条件；Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶；PCR技术的原理和DNA的复制原理是一样的，都是半保留复制。2关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法，正确的是()ATaq DNA聚合酶是从深海生态系统中发现的BDNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列CTaq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加DDNA聚合酶是以DNA为模板，使DNA子链从5端延伸到3端的一种酶解析：选DTaq DNA聚合酶是在热泉中发现的。PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列。Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用而不用另外再添加。DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，而只能从DNA单链的3端延伸子链。3多聚酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温复性及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述错误的是()APCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板CPCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变解析：选CPCR技术是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术；PCR技术的原理是DNA复制，反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，所需原料是脱氧核苷酸，以指数方式扩增；应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变。4PCR一般要经过三十多次循环，从第二次循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链作模板时将()A仍与引物结合进行DNA子链的延伸B与引物结合进行DNA子链的延伸C同时与引物和引物结合进行子链的延伸D无须与引物结合，在酶的作用下从头合成子链解析：选B当由引物延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物结合延伸DNA的子链。5在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是()循环次数不够Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制引物不能与亲链结合系统设计欠妥A BC D解析：选B循环次数过少，产物的量比预期的少；Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制会导致扩增效率低，得到的产物比预期的少；如果引物设计不合理，则无法进行扩增；PCR系统设置不妥，将达不到预期的效果。6下列关于PCR技术的叙述，正确的是()APCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上B该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶C该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的D该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、酶等条件解析：选DPCR技术不必知道目的基因的全部序列，只需知道部分序列，就可根据已知序列合成引物。PCR技术不需要解旋酶。PCR技术需要引物，但引物的序列不能是互补的，否则，在复性时，两种引物通过碱基互补配对结合而失去作用。7下列有关PCR的叙述，正确的是()APCR所需要的引物只能是RNABPCR所需要的原料是核糖核苷酸CPCR所需要的酶在60 会变性DPCR需要在一定的缓冲液中进行解析：选DPCR所需的引物是一小段DNA或RNA。PCR所需要的原料是脱氧核苷酸。PCR所需要的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶。8在PCR的实验操作中，下列说法正确的是()在微量离心管中添加各种试剂时，只需要一个枪头离心管的盖子一定要盖严用手指轻弹离心管壁离心的目的是使反应液集中在离心管的底部A BC D解析：选C在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以确保实验的准确性；盖严离心管口的盖子，防止实验中外源DNA污染；用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀；离心的目的是使反应液集中在离心管的底部，提高反应效果。9复性温度是影响PCR特异性的较重要的因素。变性后温度快速冷却至4060 ，可使引物与模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括()A由于模板DNA比引物复杂得多B引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞C加入引物的量足够多而模板链数量少D模板链加热解旋已经变性不可能再次结合解析：选DDNA双链变性解旋后是可以再次结合的，只不过是在PCR中，引物量较多，与DNA模板链结合机会大，而原来两条母链再次结合的机会小。10如图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的()A BC D解析：选D因为PCR的反应过程需要引物，在第二轮循环的产物中，a、d的引物分别为、，无引物的为模板链(即、)，则b、c的模板链分别为、。二、非选择题11PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的叙述，正确的是()A该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键C该过程不需要解旋酶的作用D该过程与人体细胞的过程完全相同(2)C过程要用到的酶是_。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以_加入，_(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有_。(3)如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸_个。(4)PCR中由碱基错配引起的变异属于_。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时一条模板链上发生碱基错配，之后正常配对，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占_。解析：(1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。Taq DNA聚合酶具有耐高温的特性，所以一次性加入即可。(3)在一个双链DNA分子中，CT占碱基总数的一半，则T的数目为(am)个，复制10次，新增加了(2101)个DNA分子，故需补充胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目为(2101)(am)个。(4)基因中碱基对的改变属于基因突变。以一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，以后按正常配对方式进行扩增，以错配链作为模板扩增的都是错误的DNA分子，原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子，故若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占3/4。答案：(1)C(2)Taq DNA聚合酶一次不需要DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行(3)(2101)(am)(4)基因突变75%(或3/4)12请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成、延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。第1组：_；第2组：_。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_。解析：(1)从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，原因：引物和引物局部发生碱基互补配对而失效；引物 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。答案：(1)15/16三(2)引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上13如图为细胞内DNA复制过程示意图，该过程在体外也可进行，以获得大量相同的DNA片段，该项技术被称为PCR技术，又称多聚酶链式反应，请分析回答：(1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是_。(2)PCR技术过程的三个步骤是：_、_、_。(3)假设PCR过程中，只用一个DNA片段作为模板，30次循环后，理论上反应物中有_个这样的DNA片段。(4)PCR技术能在几小时内将微量的DNA片段特异性地扩增上百万倍，从而解决了样品中DNA含量低，难以分离的难题，试举两例，说明PCR技术的应用：_。解析：(1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是：PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶。(2)PCR的每次循环可以分为变性、复性和延伸三个步骤。(3)由于一个DNA片段作为模板，一次循环能产生2个DNA片段，所以30次循环后，反应物中大约有230个这样的DNA片段。(4)PCR技术有广泛的应用，可以用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、亲子鉴定等方面。答案：(1)PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶(2)变性复性延伸(3)230(4)刑侦破案、亲子鉴定、疑难疾病的诊断、基因序列分析等