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报告人：南京大学谭小军二八年十一月,G-CSF的定点PEG化修饰,G-CSF(粒细胞集落刺激因子),G-CSF生理功能促进造血干细胞向中性粒细胞增殖、分化动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周G-CSF的应用抗肿瘤化疗、放疗以及骨髓移植手术后重要的辅助药物G-CSF的应用现存问题体内半衰期短易被酶水解和肾脏清除多次注射引起不良反应,PEG(聚乙二醇),具有良好的生物相容性无毒性无抗原性修饰后的蛋白和多肽类药物的药代动力学和药效学性质能够得到改善在国内外已经得到比较多的应用,项目概要,概括和总结现有蛋白质和多肽类药物的化学修饰方法；选用合适的PEG对重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）进行选择性的定点修饰改善rhG-CSF的各项性能，例如延长其在人体内的半衰期，降低其免疫原性而尽量不影响其生物活性，提高其临床应用价值,mPEG-PAL一端的甲氧基相对惰性G-CSF的端氨基与侧链氨基的等电点差=mPEG-PAL另一端醛基在偏酸性条件下特异性地与蛋白质N端氨基发生反应,mPEG-PAL（单甲氧PEG丙醛）,最佳修饰反应条件的摸索！,Figure1.SDS-PAGEanalysisoftheorthogonalsamplesstainedwithCoomassieBlue.Lane1-9:ninesamplesintheorthogonaltestscorrespondingtothetestnumber.,正交实验确定最佳反应条件,TheOptimalConditions:,Time：48hourspH：5.0Temperature：20MolarratioPEG/rhG-CSF：10:1,最佳条件反应结果,Figure2.Muchmono-PEGylatedrhG-CSFwasobtainedundertheoptimalconditions(48h,pH5.0,molarratioofmPEGtorhG-CSF10:1;20),morethanundertheconditionsofTest5or7intheorthogonaltests.,AB,放大反应分离纯化,Figure3.Theprofileofcationexchangefastproteinliquidchromatogram(CTAFPLC)ofthePEGylatedrhG-CSF.TheaveragemolecularweightsofmPEG-PALusedare(A)20kDaand(B)5kDa,respectively.,PEG(5kD)-G-CSF纯品,Figure4.TheFPLCprofileofPEG(5kD)-G-CSFafterpurification.,PEG(20kD)-G-CSF纯品,Figure5.TheFPLCprofileofPEG(20kD)-G-CSFafterpurification.,Mono-PEG-G-CSF纯品,LANEA:MarkerLANEB:Mono-PEG(5kDa)-G-CSFLANEC:Mono-PEG(20kDa)-G-CSFLANED:G-CSF,Figure6.SDS-PAGEanalysisofthepurifiedmono-PEG-G-CSFstainedwithCoomassiebrilliantBlue.,Mono-PEG-G-CSF体外活性,Figure7.PEGylationRetainedtheActivityofrhG-CSFinvitro.(AlthoughTherelativeactivitiesofPEG(5kD)-G-CSFandPEG(20kD)-G-CSFwasdown-regulatedtoabout67%and40%,respectively,ofthatofunmodifiedrhG-CSF.),Mono-PEG-G-CSF热稳定性,Figure8.PEGylationincreasedthethermalstabilityofrhG-CSF.Left:pH7.0in37;Right:pH7.0,at60,Mono-PEG-G-CSFpH稳定性,Figure9.PEGylatedrhG-CSFhaddistinctlyhigheracid-basestabilitythanunmodifiedrhG-CSF.Left:pH2.2;Right:pH11.0.,Mono-PEG-G-CSF体外稳定性,Figure10.PEGylationsignificantlyenhancedproteolyticstabilityofrhG-CSF.Left:humanserum;Right:trypsin.,Mono-PEG-G-CSF的体内活性,Figure11.Theactivityofmono-PEG-G-CSFtoincreaseleukocytenumbersintheperipheralbloodofKunmingmiceissignificantlyhigherthanthatofunmodifiedrhG-CSF.,结论,PEG化修饰表面上降低了rhG-CSF的体外比活但是显著增加了rhG-CSF的体内外稳定性，起到体内缓释作用，大大延长了体内作用时间，显著提高了其体内活性,巨大的临床应用前景！,感谢导师陈钧辉教授的悉心指导感谢聂永军老师、沈杰师兄的热情帮助感谢苏州中凯生物公司免费提供rh-G-CSF样品感谢南京大学创新计划项目管理办公室的辛勤管理与大力支持,致谢,谢谢各位专家与同学！,
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