实验芸香苷的提起

实验九 槐花米中芸香苷的提取、分离与鉴定【实验目的】1.掌握碱溶酸沉法提取芸香苷的操作技术。2.掌握以水为溶剂精制芸香苷的原理和方法。3.了解芸香苷的鉴定方法。4.了解酸水解法制备黄酮苷元的操作方法。课型：实验课 课时：12学时重点：碱溶酸沉法酸碱度的调节、控制。难点：碱溶酸沉法酸碱度的调节、控制。【实验材料】槐花米、石灰乳、0.4%硼砂水溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、乙醇、70%乙醇、1%氢氧化钠溶液、1%三氯化铝乙醇溶液、2%氯氧化锆甲醇溶液、2%枸椽酸甲醇溶液、10% -萘酚乙醇溶液、浓硫酸、2%硫酸溶液、葡萄糖标准品、鼠李糖标准品、芸香苷标准品、槲皮素标准品、碳酸钡、氨制硝酸银试液、广泛pH试纸、中速层析滤纸（4cm15cm）。 【实验原理】（一）芸香苷又名芦丁（Rutin），维生素P，紫槲皮苷。分子式C27H30O16，分子量610.51。浅黄色针晶（水），mp.176178， +13.82(乙醇)，-39.43（吡啶）。在各种溶剂中的溶解度为：难溶于冷水（1800010000）、可溶于热水（1200）、热甲醇（17）、冷甲醇（1100）、热乙醇（160）、冷乙醇（1650）、可溶于吡啶及碱性溶剂，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿及石油醚等溶剂。由于分子中含有多个酚羟基，易被氧化，在空气中久置会使芸香苷颜色加深，尤其在碱性溶液中更易氧化。（二）槲皮素（Quercetin）又名栎精，槲皮黄素。分子式C15H10O2，分子量 302.23。为黄色针状结晶（稀乙醇），含2分子结晶水，在9597成为无水物。mp.314（分解）。能溶于冷乙醇（1290），易溶于沸乙醇（123），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸及吡啶等溶剂，不溶于水、苯、乙醚、氯仿及石油醚等溶剂。（三）其他成分槐花米甲、乙、丙素（Sophorin A、B、C）、白桦脂醇（Betulin）、槐二醇（Sophoradiol）、单宁等。本实验利用芸香苷分子结构中含有多个酚羟基，显弱酸性，能与碱作用生成盐而溶于碱水，加酸酸化后又能沉淀析出的性质，采用碱溶酸沉淀法进行提取。利用芸香苷在热水中溶解度大，在冷水中溶解度小的性质，用水作溶剂进行重结晶精制。【实验内容】一、芸香苷的提取称取槐花米20g（压碎），加0.4%硼砂水溶液200ml，在搅拌下加石灰乳调节pH89，加热煮沸20分钟，随时补充失去的水分和保持pH89，倾出上清液，用四层纱布趁热过滤，滤渣同样操作再提取一次，过滤，合并两次滤液，放冷，用盐酸调节pH23，放置析晶，待全部结晶析出后，抽滤，用纯化水洗涤结晶，抽干，室温干燥，得芸香苷粗品，称重，计算收得率。二、芸香苷的精制称取粗品芸香苷2g，充分研细后置于烧杯加纯化水400ml，煮沸至芸香苷全部溶解，趁热抽滤，滤液放置析晶，抽滤，得芸香苷精品（若含杂质过多，可加入适量乙醇回流溶解，并加入约0.5%活性炭继续回流30分钟，抽滤，滤液放冷析晶，抽滤，得芸香苷精品）。置空气中晾干或于6070下干燥，称重，计算收得率。三、芸香苷的水解取芸香苷1g，研细后置于圆底烧瓶中，加入2%硫酸水溶液80ml，加热微沸30分钟，待出现的鲜黄色沉淀不再增加为止，放冷，抽滤，保存滤液用于制备糖的色谱检识的供试液，沉淀物用纯化水洗至中性，晾干，得粗制槲皮素。再用70%乙醇重结晶得黄色小针状槲皮素结晶，晾干，称重，计算收得率。四、芸香苷的检识（一）化学检识1.盐酸镁粉反应：分别取芸香苷和槲皮素少许，分别用12ml乙醇水浴微热溶解，加入镁粉适量，浓盐酸数滴，观察并记录实验现象。2.三氯化铝反应：将芸香苷和槲皮素的乙醇溶液分别点在滤纸片上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液1滴，于紫外灯下观察荧光，并记录实验现象。3.锆枸椽酸反应：取芸香苷和槲皮素少许，分别用12ml乙醇水浴加热溶解，加入2%氯氧化锆甲醇溶液34滴，观察现象，然后各加入2%枸椽酸甲醇溶液34滴，观察并记录实验现象。4.Molish反应（-萘酚浓硫酸试验）：取芸香苷和槲皮素少许，分别用12ml乙醇溶解，加10%-萘酚乙醇溶液1ml，振摇后倾斜试管，沿试管壁缓缓加入约1ml浓硫酸，静置，观察二液界面颜色变化，并记录实验现象。（二）色谱检识1.芸香苷和槲皮素的纸色谱色谱材料：新华中速色谱滤纸（4cm15cm）。展开剂：正丁醇醋酸水（451上层）。供试品：实验产品1%芸香苷乙醇溶液与实验产品1%槲皮素乙醇溶液。对照品： 1%芸香苷标准品乙醇溶液与1%槲皮素标准品乙醇溶液。显色剂 ：自然光下或置紫外光下观察。喷洒1%三氯化铝乙醇溶液后，再于紫外光下观察荧光。观察记录：记录图谱及斑点颜色，分别计算各斑点的Rf值。2.糖的纸色谱检识色谱材料：新华中速色谱滤纸（4cm15cm）。展开剂：正丁醇醋酸水（451上层）。供试品：取水解芸香苷之后的滤液，置水浴上加热，在搅拌下加适量碳酸钡细粉中和至中性（pH7），过滤，滤除沉淀物，滤液浓缩至1ml左右，放冷后供纸色谱点样用。对照品：1%葡萄糖标准品溶液与1%鼠李糖标准品溶液。显色剂：喷洒氨制硝酸银试液后，先用电吹风冷风吹干，然后再用热风吹至出现棕褐色斑点为止。喷苯胺邻苯二甲酸试剂，于105加热10分钟，显棕色或棕红色斑点。观察记录：记录图谱及斑点颜色，分别计算各斑点Rf值。【实验说明及注意事项】1.提取芸香苷时加入硼砂的目的是为了保护结构中的邻二酚羟基不被氧化，并使邻二酚羟基不与钙离子络合（因钙盐络合物不溶于水），使芸香苷不受损失，提高产率。2.加入石灰乳既可以调节提取液的pH值，使提取过程在碱性条件下进行，又可以与槐花米中共存的多糖类成分（黏液汁、果胶等）生成钙盐沉淀而使之除去。实验过程中应严格控制溶液的pH值和加热煮沸的时间，以保证产率。3.用浓盐酸酸化时，调节溶液pH值不能过低（一般为pH34），否则会使析出的芸香苷沉淀与酸生成钅羊 盐而重新溶解，使收得率下降。4.芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱，也可用圆形滤纸，用径向展开，一次就能完成。展开后，将滤纸剪开，芸香苷、槲皮素用三氯化铝显色，糖用氨制硝酸银试液显色。5.芸香苷的提取方法除了碱溶酸沉法外，还可以利用芸香苷在热水中溶解度大，在冷水中溶解度小的性质，用沸水为溶剂进行提取，提取液放冷即得芸香苷粗品。也可用乙醇或甲醇为溶剂用回流法提取，提取液回收溶剂后所得的浸膏，经除去脂溶性杂质后，纯化水洗涤，过滤，沉淀物干燥即得芸香苷。6.槲皮素以乙醇重结晶时，如所用的乙醇浓度过高（90%以上），一般不易析出结晶。此时可在乙醇溶液中滴加适量纯化水，使呈微浊状态，放置，槲皮素即可析出。【思考题】1.试述从槐米中提取、精制芸香苷的方法及原理。2.用碱溶酸沉法提取芸香苷为什么用石灰乳而不用氢氧化钠调节溶液的pH值