慢病毒生产与使用操作手册

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（）精心整理总结。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLVTM系列质粒。1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。3、菌株 大肠杆菌菌株DH5。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 预热的 10 DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 68 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10 DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n万/mL 细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3 x 106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）293T细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。4、将培养皿平稳放回37、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。（三）293T细胞的复当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复。1、设置温度为3742的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在12min使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。5、将培养皿平稳放入37、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。四、慢病毒包装和浓缩（一）质粒扩增构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去毒素抽提。（二）传293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10 DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10 DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL 10DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90满即可进行转染。转染前无需换培养基。（三）做脂转complexDMEM需在37度水浴中预热，LipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下：pspax10gPMD2G10gpHBLVTM系列载体10g转染后6h换新鲜培液。注：LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。（四）病毒收集转染后48和72h分别两次收集病毒上清(24h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 m滤器过滤,于40 mL超速离心管中，4，72000g/min离心120分钟；（五）病毒重悬和保存500ul 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的细胞（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。（二）病毒感染1.polybrene的选择：Polybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用110g/ml的围筛选合适的浓度，以24h细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度为68g/ml。注： 1）汉恒生物的自产的Polybrene 产品，用户可用以进行辅助感染。提供的Polybrene母液保存在-20（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4可保存2周。 2）Polybrene预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene 的使用参见附表2。2. 感染细胞最佳MOI的测定MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=13时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。3.感染步骤按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37 培养过夜。对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和 Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于 24 孔板，其他孔板请相应调整体积。）对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。感染前，从冰箱取出并在37水浴中快速融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻8字混匀。（具体加入的病毒数可参考附表1）37小体积感染4小时，4小时后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格如下）病毒小培养体积感染表培养皿类型表面积/cm2对应细胞培养液体积病毒感染对应细胞培养液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm 20cm24ml2ml100mm 60cm210ml5ml慢病毒感染4小时后补足至培养体积，感染24小时后换液，腺病毒感染2小时后直接换液感染后第二天（约24小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37培养。 感染后48小时，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。注意： 溶化的 shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。4.Puromycin抗性筛选：Puromycin标准的施加终浓度围为110g/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的puromycin。部分细胞puromycin参考值Cell lineSpeciesPuromycin (g/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB-Human1-3HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Human embroyonic stem cells（Human ESCs）Human1更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被puromycin杀光，可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。不挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。扩增完毕后western blot或者QPCR检测目的蛋白的表达。挑取表达适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。5. 感染悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（500g-1000g/min）离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。6. 对于极难感染的细胞对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24小时后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。附1：汉恒生物慢病毒质粒图谱过表达1.单标记2.双标记IRES载体慢病毒过表达载体，ZSGreen/puro标记T2A系列载体：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-Puro Luc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc干扰1.单标记2.双标记IRES系列载体慢病毒shRNA干扰载体，ZSGreen/puro标记T2A系列载体：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-PuroLuc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc特殊用途用于融合蛋白构建 慢病毒载体启动子替换Tet-on system 慢病毒载体：单病毒系统，无须另外表达rtTA，出毒率低，只做建系用，无法提供病毒Tet-on过表达系统，目的基因插入MCS区，只在DOX存在下才表达，puro可持续表达，用于筛选 Tet-on干扰系统，应用mir30的sh-mir结构，与tuboRFP融合表达，加DOX时RFP和sh-mir结构启动表达，因此会看到加Dox后24小时有荧光出现；puro为持续表达，用于筛选注意：sh-mir合成非常贵附2：慢病毒滴度测定方法简介:1、细胞准备 将生长状态良好的 293T 细胞消化计数后稀释至1x105/ml, 加入96孔板，100ul/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37，5%CO2 培养箱中培养。2、加病毒 第二天，在 EP 管中做3倍梯度稀释，连续6个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备6个1.5mlEP 管，每管加入90ul 培养液，往第一个管中加入10ul病毒原液，混匀后，吸取10ul 加入第二个管混匀。以此类推，做十个稀释度（103*10-3）。3、追加培养液第三天，吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100ul 完全培养液，以利于细胞的生长。4、观察结果并计算滴度第五天，在荧光显微镜下观察结果。滴度（PFU/ml）=细胞数*荧光百分比*MOI*病毒稀释倍数*103附3：汉恒生物目的细胞慢病毒感染复数（MOI）与体积对应表规格大约数目MOI值加入病毒数量慢病毒MOI摸索时加入的体积梯度/ul96well2-510420-500.4-2.51064-25ul4；12；2048well1-210520-500.2-110720-100ul20；60；10024well2-310520-500.4-1.510740-150ul40；120；20012well510520-501-2.5107100-250ul100；300；5006well1-210620-500.2-11080.2-1ml200；600；100035mmdish1-210620-500.2-11080.2-1ml200；600；100060mmdish2-410620-500.4-21080.4-2ml400；1200；2000100mmdish6-1010620-501.2-51081.2-5ml1200；3600；6000150mmdish1-210720-500.2-11092-10ml2000；6000；10000慢病毒滴度以108/ml为准，其他滴度需相应换算;大约细胞数目是根据80%100%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。注： 1）24板长满了细胞大约有3105个细胞。 如果一天后要长到70（2.1105）， 建议1.21.4105个细胞。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件，不会达到24小时翻一倍的速度。其他规格培养可参照此确定相应culture细胞量。2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。 附4：慢病毒MOI感染参数注：不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI值也略有差异，以下数据是在细胞感染效率在85-100%细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。 细胞系名称细胞描述MOI值围能否添加polybreneK562人白血病细胞2040可Jurkat人白血病细胞株5080不可kasumi人白血病细胞株1030不可NB4人白血病细胞株5080不可U937人单核细胞2040可THP-1人单核细胞株5080可GBC-SD人胆囊癌细胞株3050不可H929人多发性骨髓瘤症细胞系100150不可H1299人非小细胞性肺癌细胞13可95D人肺巨细胞癌24可A549人肺腺癌2040可SPC-A-1人肺腺癌细胞100150可7402人肝癌细胞1015可Hep 3B人肝癌细胞1030可Hep G2人肝癌细胞1030可SMMC-7721人肝癌细胞1030可Huh-7人肝癌细胞系1030可Hela人宫颈癌细胞株1030可HOS人骨肉瘤细胞系2040可Hep-2人喉癌细胞株1030可HL-60人急性髓系白血病细胞株100可HT-29人结肠癌细胞1030可PKO人结肠癌细胞24可SW480人结肠癌细胞株1030可DLD-1人结直肠肿瘤细胞株1030可SK-OV-3人卵巢癌细胞株24可SHG-44人脑胶质瘤细胞1030可U251人脑胶质母细胞瘤13可U87人脑星型胶质母细胞瘤13可293T人胚肾上皮细胞13可HUVEC-2C人脐静脉血管皮细胞1030可PC-3人前列腺癌细胞2040可MDA-MB-231人乳腺癌细胞1030可MCF-7人乳腺癌细胞株2040不可Tca8113人舌鳞状细胞癌1030可RPE人视网膜色素上皮细胞1030可AGS人胃癌细胞100150可BGC-823人胃癌细胞100150可SGC-7901人胃癌细胞1030可MKN-28人胃癌细胞株2040可MKN-45人胃低分化腺癌细胞株2040可BxPc-3人胰腺癌细胞2040可CFPAC-1人胰腺癌细胞5080可Panc-1人胰腺癌细胞24可HEC-1-B人子宫膜癌细胞株24可NIH-3T3小鼠成纤维细胞系2040可Raw264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞1030（感染后分化）不可CHO中国仓鼠卵巢细胞2040可HSC-T6大鼠肝星型细胞1030不可C6大鼠脑胶质瘤细胞100可NRK大鼠肾细胞1030可附5：汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接加入直接加入直接加入换液时间感染后2h感染后24h感染后24h是否需要筛选不需要，腺病毒感染能力很强需要筛选获得稳定感染株，慢病毒的感染能力不强需要筛选获得稳定感染株，逆转录病毒的感染能力不强观察时间如带有GFP等荧光标签，24h后可观察到荧光，36h可达到表达高峰，若不带有荧光标签，则需要鉴定带有GFP等荧光标签，24h后可以观察到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不可直接观察到，需要鉴定带有GFP等荧光标签，24h后可以观察到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不可直接观察到，需要鉴定是否需要助转剂不需要有时需要，但是根据具体情况操作，因为助转剂，如polybrene，对细胞的伤害比较大，有的细胞可能承受不了有时需要，但是根据具体情况操作，因为助转剂，如polybrene，对细胞的伤害比较大，有的细胞可能承受不了附6：汉恒生物病毒包装周期表腺病毒慢病毒过表达干扰过表达感染目的序列获得35天24天目的序列获得35天24天穿梭质粒构建312天312天重组表达质粒构建812天812天质粒重组510天510天慢病毒包装510天510天腺病毒包装1215天1215天病毒浓缩（可选）12天12天大量扩增1215天1215天滴度测定35天35天纯化（可选）1421天1421天目的细胞感染，筛选14天14天滴度测定35天35天过表达/干扰效率验证3天3天时间总计5283天5182天时间总计3749天3648天附7：动物实验对腺病毒和慢病毒的要求及实现方式腺病毒慢病毒是否需要纯化及方法需要纯化，纯化方法：CsCl梯度离心不需要纯化是否需要浓缩及浓缩方法纯化之前需要浓缩，PEG8000沉降法需要浓缩，浓缩方法：超速离心法或PEG8000沉淀法。实现方式注射注射附8：病毒的保存条件与运输条件腺病毒慢病毒保存条件分装于-80度长久保存；一周使用可保存于4度。忌反复冻融。六个月后再次使用，需要重新测定病毒滴度。分装于-80度长久保存；一周使用可保存于4度。勿反复冻融。六个月后再次使用，需要重新测定病毒滴度。0运输条件用普通的冰袋，不可以用干冰运输，因为干冰所造成的CO2气体环境会大大降低缓冲液的pH值，从而极大影响腺病毒在缓冲液中的稳定性。但如果使用封口严密的西林瓶或安培瓶包装腺病毒，则可以用干冰运输。先将病毒保存于-80度，然后全程干冰运输附9：慢病毒收到后的注意事项1、慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 保存（尽量一周用完）；如需长期保存请放置于-80。注：a反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（100ul/tube），收到后直接放置-80保存即可。b如果病毒储存时间超过6个月，我们建议使用前重新测定病毒滴度。2、慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4保存(请尽量一周用完)。以上容由汉恒生物科技（）精心整理总结，公司专注于为广大科研工作者提供腺病毒、慢病毒、逆转录病毒包装、细胞稳定株筛选、siRNA设计和microRNA研究服务。若您有任何技术问题即可联系我们()。如若引用，请注明出处，所有解释权最终归汉恒生物所有。