《基因工程制药综合实验》大纲 - 实验教学示范中心- 东北农业大学

东北农业大学本科实验课程教学大纲实验课名称 基因工程制药实验实验课英文名称 Vaccinology Comprehensive Experiments一、理论课程（或实验课程）课号：09610043z适用专业：制药工程理论课程总学时：72实验总学时（周学时）：4学分：1.5开出实验个数：（验证实验 0 个；综合实验 2 个；设计实验 1 个；创新性实验 1 个）应开实验学期：第5学期二、实验课程简介现代生物技术是当期影响国民经济的四大科学支柱之一，而以基因工程药物为中心的医药生物技术则是生物技术领域中最为活跃、发展最为迅速的部分。基因工程药物是指利用基因工程技术研制和生产药物，主要包括蛋白多肽药物、反义核苷酸、DNA药物和基因工程抗体等等。基因工程制药学实验是将基因工程制药的理论与实际融为一体并付诸实践的重要课程。本课程涵盖了从基因重组，克隆和表达的设计与构建，到基因工程菌的培养以及基因产物的分离纯化及分析过程，及最后的生物学活性评价。三、实验教学目标及基本要求要求学生有强烈的事业心，热爱制药工程专业，理论和实践相结合，更深入的理解和掌握基因工程药物的工程原理与技术。1通过实验教学加强学生对基因工程药物的基本概念、制造原理、试验操作技术的理解与掌握。2通过实验教学使学生了解和掌握生产蛋白多肽所用仪器的各种参数、适用范围以及使用方法。3通过实验教学培养学生的动手能力，加强学生实验技能的训练，培养学生运用所学的理论知识解决生产实践中所遇到的实际问题。四、教材及主要参考书1 生物技术制药张林生 主编， 出版社：科学出版社。（2008年第一版）.2 .现代生物制药工艺学齐香君主编，出版社：化学工业出版社。（2004年第一版.）3 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYFrederick M. Ausubel主编.，出版社：John Wily Sons, Inc。（2006年.第一版）4 生物技术制药李德山 主编，出版社：东北农业大学。（2007第一版）5 基因工程药物李元 主编，出版社：化学工业出版社。（2007第二版.）五、考核办法操作技巧，出勤率，实验态度，实验报告。大纲主撰人：李德山第一部分 基因克隆（一）动物组织RNA的提取1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业 计划学时： 4 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求掌握的原则和要求，熟悉RNA的提取的制备过程。写出实验报告，叙述RNA的提取的原则与要点并附结果。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1高速冷冻离心机Beckman12高压湿热灭菌器国产13温箱DHG-9240A14电泳仪国产15电泳槽国产66制冰机国产17提篮式液氮罐8凝胶成像系统4实验内容提要实验过程：用液氮研磨肝脏，使肝脏细胞破碎。氯仿可除去杂蛋白，异丙醇可对RNA进行抽提，75%乙醇可脱去RNA中的盐类，对其进一步纯化。 5实验操作要点整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在冰上操作。并且整个操作要快速进行。6注意事项Trizol有毒，要注意防护。（二）RT-PCR目的基因扩增1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求学习并掌握RT-PCR法基因扩增的过程和要点。写出实验报告，记述RT-PCR法基因扩增步骤和操作要领。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1水浴锅国产22高压湿热灭菌器YXQ-WF22DS-K13PCR仪国产14制冰机国产15电泳仪国产16电泳槽国产67凝胶成像系统4实验内容提要将提取到的mRNA作为模板，加入引物，dNTP，反转录酶。从而反转录出cDNA。对反转录出的在特定引物存在下进行 PCR，从而得到大量的扩增产物，及暨我们的目的基因。5实验操作要点整个操作要带口罩及一次性手套，6注意事项注意防止外界污染。（三）目的片断与载体的连接1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业基础 计划学时： 4 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求掌握质粒提取，核酸的酶切连接、PCR纯化及回收的操作基本过程。写出实验报告，简述上述操作要点。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1水浴锅国产22高压湿热灭菌器YXQ-WF22DS-K13摇床国产14离心机国产65电泳仪国产16电泳槽国产37凝胶成像系统4实验内容提要将目的片断（PCR产物）及载体质粒用相应的限制性酶切割成粘性末端，通过胶回收纯化产物，并在连接酶的作用下将两者连为重组质粒。5实验操作要点1、质粒和插入片断纯度要好2、控制酶切和连接时间3、插入片断与载体之间的比例要控制好6注意事项 防止污染，注意紫外防护。（四）感受态细胞的制备和转化1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业 计划学时： 4 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求掌握感受态细胞制备和转化过程。写出实验报告，简述感受态制备和转化的过程与要点。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台SW-CJ22高压湿热灭菌器YXQ-WF22DS-K13大容量低温离心机14制冰机国产15摇床国产15水浴锅国产14实验内容提要用钙离子将大肠杆菌的细胞壁变脆，通过热激法将外源质粒转入细胞中，依靠抗性基因筛选阳性细胞。5实验操作要点1、菌体的生长状态6注意事项 无菌操作，防治污染。（五）阳性菌株的筛选和鉴定1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求掌握阳性菌株的筛选和鉴定的方法。写出实验报告，简述改过程的要点。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台SW-CJ系列22高压湿热灭菌器YXQ-WF22DS-K13温箱DHG-9240A14水浴锅国产25离心机国产66摇床国产17PCR仪国产18电泳仪国产19电泳槽国产610凝胶成像系统4实验内容提要1、菌株扩大培养2、质粒提取3、PCR和酶切鉴定5实验操作要点1、防止污染第二部分 蛋白的表达纯化（一）蛋白表达条件优化1实验特点实验类型： 设计 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 开日期：2实验目的与要求了解蛋白表达的必要条件和优化过程，写出试验报告，简述不同条件下蛋白表达变化。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台SW-CJ系列22高压湿热灭菌器YXQ-WF22DS-K13温箱DHG-9240A14摇床国产15控温摇床国产16超声波破碎仪17电泳仪国产18垂直板电泳槽国产29电磁炉国产110低温层析柜11电动移液器4实验内容提要观察不同诱导条件（IPTG浓度，诱导温度及时间）下，目的蛋白表达量及表达状态的变化。5实验操作要点1、IPTG浓度的变化2、低温培养和常温培养的对比3、诱导时间长短的对比4、培养方式（剧烈或温和）的对比6注意事项 各实验组要注意平行，避免人为误差。（二）融合蛋白的纯化1实验特点实验类型： 综合 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求了解AKATA系统原理，掌握利用该系统纯化蛋白的方法。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1AKATASW-CJ12电泳仪国产13垂直板电泳槽国产24控温摇床5紫外检测仪6蠕动泵7电动移液器8低温层析柜4实验内容提要利用AKATA系统纯化融合蛋白。5实验操作要点1、上样压力不能过大6注意事项注意仪器维护（三）蛋白修饰和热源检测1实验特点实验类型： 创新 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求了解蛋白标签的去除方法，及了解热源检测法评价蛋白纯度。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1AKATASW-CJ12电泳仪国产13垂直板电泳槽国产24电子体温计15水浴锅国产16紫外检测仪7蠕动泵8低温层析柜4实验内容提要利用SUMO蛋白酶去掉融合蛋白上的蛋白标签，并利用AKATA系统纯化最终的目的蛋白。通过注射兔子观察产品中热源情况，评价最终产品是否可以使用。5实验操作要点1、蛋白切割时间2、血液注射蛋白3、检测注射后兔子的体温6注意事项注意防止被动物咬伤注意仪器维护第三部分 蛋白的生物学功能评价（一） 糖尿病动物模型的制备1实验特点实验类型： 创新 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求为了测定表达的蛋白的生物学功能，需要制备动物模型来检测。掌握糖尿病性动物模型制备的方法和原理及评价办法。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台SW-CJ系列22老鼠饲养箱国产63纯水仪14血糖仪国产14实验内容提要STZ可有效破坏胰脏组织，注射STZ后，小鼠7天内出现血糖升高等典型糖尿病现象。5实验操作要点1、无菌配置STZ药液2、腹腔注射药液3、检测小鼠血糖6注意事项STZ药液有毒，注意防护（二）蛋白的生物学功能评价1实验特点实验类型： 创新 实验类别：专业 计划学时： 6 每组人数：5 首开日期：2实验目的与要求给糖尿病小鼠注射制备的蛋白观察血糖、心跳及体温等其他生理指标的变化。3主要仪器设备序号主要仪器设备名称型号规格数量1血糖仪国产12生物机能实验系统14实验内容提要通过不同剂量的注射，观察动物生理指征的变化从而评价蛋白的生物学功能。5实验操作要点1、多途径给药；2、观测血糖及其他生理指标。6注意事项蛋白注射的途径和剂量。现代生物技术是当前影响国民经济的四大科学支柱之一，而以基因工程药物为中心的医药生物技术则是生物技术领域中最为活跃、发展最为迅速的部分。目前，基因工程药物主要以蛋白多肽类产品为主，由于不同蛋白之间性质的差别很大，因此针对每一个蛋白都要摸索出与其相对应的纯化程序和条件，因求获得高纯度，高活性且低成本的目的蛋白。因此蛋白纯化技术是基因工程药物商业化的关键，目前人才市场上对蛋白纯化提纯技术人员需求量较大。目前本科教学试验中往往采用手工蛋白提取，虽然成本较低，但与实际生产脱节，使我们的学生无法达到医药企业期望的制药专业毕业生应达到的水平，降低了我校毕业生的市场竞争力。AKATA蛋白纯化系统是目前国内外生物医药公司普遍采用的蛋白生产仪器，它通过优化后的程序生产的蛋白可以直接使用。通过对该系统的学习，学生不仅可了解蛋白纯化的原理，还可以直接接触实际生产，使我们培养的学生更适合医药企业的需要，提升市场竞争力。由于AKATA蛋白纯化系统具有高效的蛋白分离纯化能力，除了满足本科生试验外，该系统还可以解决以往手工提纯蛋白纯度低，不易用于后续科研的问题。此外，程序化的机器操作可有效屏蔽人为误差，使结果更加真实可信，可有效节约人力物力，有效提升我院科研实力。综上所述，我们认为，该系统可有效提高我院的教学质量及科研能力。希望能够批准引进。第一篇 分子克隆技术基础知识第一章 基因工程载体基因工程载体是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。 容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。 有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。第一节 质粒载体一、质粒的生物学特性质粒是指在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制并且在细胞分裂时能恒定的传递给子代细胞的独立遗传因子。质粒的生物学特性，如下：（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA） DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb，只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid），拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid），拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性。两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存；载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。（6）质粒的转移。转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。二、质粒DNA的制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。（一）碱变性法提取质粒的原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.0-12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。（二）碱变性法提取质粒的步骤（1）取1.5 ml含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；（2）加入100 l冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH8.0)，10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。（3）加入200 l新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5 min。（4）加入150 l冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4g，冰乙酸11.5 ml，加蒸馏水至100 ml）颠倒离心管10次后，冰浴5 。（5）离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。（三）质粒载体的改造质粒载体的改造，策略如下：（1）去掉不必要的DNA区段。（2）减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个（单一的限制性酶切位点）。（3）加入易于检出的选择性标记基因。（4）对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。（5）改造或增加基因表达的调控序列。1、质粒pBR322结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr） 内部有3种限制酶单一识别位点 。（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。（3）DNA复制起点（ori）pBR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量。4363bp，2.6106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。2、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)核苷酸序列发生了变化。（3） LacZ基因 编码半乳糖酶的肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500-700个拷贝。（2）适用于组织化学法检测重组体通过a-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。图1-1 pUC18/ pUC19图谱现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。图1-1给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解-内酰胺环，从而被坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG和X-gal时，lacz 基因被诱导表达产生的-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为-互补，-complementation），半乳糖苷酶水解X-gal而使菌落呈现蓝色；在lacz 中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacz 编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。除常用的大肠杆菌质粒载体外，近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个Ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体（shuttle vectors）。第二节 噬菌体载体噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，加入噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的噬菌体改造成的载体应用最为广泛。噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖（图1-2）： 溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，DNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，DNA经多次复制合成许多子代DNA，于是装配成许多子代的噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的噬菌体。 溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的DNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的DNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶原菌(lysogen)。DNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。图1-2 噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式一、l噬菌体载体（一）噬菌体的生物学特性烈性噬菌体：只具有溶菌生长周期温和噬菌体：具有溶原生长周期和溶菌生长周期溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶原周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶原性细菌。在溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。（二）l噬菌体的生物学特性1、组成l噬菌体由蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。lDNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。2、是一个温和噬菌体一般以溶原生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。3、复制溶原周期随溶原细菌染色体一起复制；溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制。4、基因组成lDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约13为非必须区段。（三）l噬菌体载体的类型1、插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如gt10和gt11 ，其克隆能力小，不到10 kb。2、置换型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体，其克隆能力大，20-25kb。二、M13噬菌体1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性M13噬菌体是单链闭合环状噬菌体，只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。2、M13噬菌体载体的构建（1）在IS区内插入LacZ基因（2）在标记基因区内组装MCS区段所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18、19等。这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。三、柯斯质粒载体1、柯斯质粒载体的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成：（1）多克隆位点区（2）含有cos位点的lDNA区（3）复制起始位点和抗性标记区2、柯斯质粒载体的特性（1）具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。（2）具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。（3）高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。表1-1 四种常用载体的比较质粒噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段*+-构建基因组文库-+-构建DNA文库+-常规的亚克隆化+-构建新型的DNA结构+-序列分析+-+单链探针+*-+外源基因在大肠杆菌中的表达+-噬菌体整个基因组如图1-3所示，可分为三个部分，左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：设计去除DNA上的一些限制性酶切点。这是因为DNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的gt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。图1-3野生型噬菌体DNA及相应的噬菌体DNA图谱插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。如果将左右臂和中段都去除，仅留下DNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。第三节 动物病毒载体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点（centromere）及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体。（三）猴病毒40（SV40）猴病毒40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原。早已证明完整的小鼠染色体珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠珠蛋白的初级转录本。可是，SV40作为克隆载体有其局限性：SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源DNA的重组和表达；早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；重组DNA片段的大小受体限制。（四）逆转录病毒逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（onc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。第四节 其他载体现在提到的分子载体有的不是用于克隆某基因，而是作为外源基因进入受体细胞的运载工具。（一）转座子载体这里主要提一下有关果蝇转座因子（P因子）作为基因载体。因为这是很有希望的真核生物基因工程的载体，果蝇的P因子约长3kb，每端各有反向重复顺序，当它插入基因组时，可以激活或灭活近旁的基因，当它从基因组上切下来时，也可能把近旁的基因或DNA顺序一起切下而引起突变。现在已能把带有某种限制酶切点的P因子克隆到质粒pBR322中，然后在P因子酶切点上插入外源DNA。经过扩增后，将这种重组DNA用微量注射仪直接注入果蝇的受精卵中。结果所克隆的基因能随P因子插入受体细胞的基因里，并且得到表达。（二）人工微小染色体包括人体在内的高等生物基因工程中遇到的一个难题是缺乏合适的基因载体。要求载体对受体细胞没有危害，能安全、稳定地转给后代，使基因的性状得到连续的表达。这对校正某种遗传缺陷或改进某种性状都是十分有用的。目前一些实验室正致力于构建人工微小染色体（microchromosome）。构建染色体应包括：基因、复制起点、着丝粒和端粒。染色体上需带有基因是不言而喻的。复制起点是染色体复制所不可缺少的。着丝粒保证复制后的染色体均等地分配到两个子细胞中。端粒具有某种特定结构以保证染色体的个体性。首先，构建的是酵母的人工微小染色体。天然的酵母染色体为150-1000kb。人工构建的微小染色体长55kb，在细胞内很稳定，只是每个细胞里的拷贝数很少。比如已构成的人工微小染色体为7-15kb，每个细胞里的拷贝数虽然增多，但不够稳定。人工构建酵母微小染色体的具体步骤见图1-4。从图中可以看到，先用质粒pBR322为材料，连接酵母的标记基因Leu2（亮氨酸）后去转化大肠杆菌，然后再接上酵母染色体上分离得到的着丝粒CEN3，再去转化大肠杆菌以增殖重组质粒，取得下一步实验用的DNA。接下去是连接从酵母（真核生物）中分离得到的ARS1。ARS是指自主复制顺序（autonomously replicating sequence），这个顺序中可能包含着复制起点。目前已从非洲爪蟾的线粒DNA，衣藻和烟草叶绿体和核DNA中分离ARS。最后一个步骤是接上染色体端粒。用的是四膜虫（tetrahymena）的rDNA末端（Tr末端）。这样构建成的质粒去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状重组DNA分子，可以象天然染色体一样地复制和分离，这就是酵母线状质粒YLp4。图1-4构建酵母人工微小染色体的步骤载体（vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希氏菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。第二章 工具酶工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。限制性内切酶有型和型限制性DNA内切酶之分，型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分平端和粘端，产生3-OH和5-P末端（见表2-1）。限制性内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1g DNA/2-5单位酶）等反应条件。表2-1 Alu 和Eco R识别顺序和切割位点酶识别序列切口Alu AGCTAG CT四核苷酸TCGATC GA平端切口Eco RGAATTCG AATTC六核苷酸CTTAAGCTTAA G粘端切口连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希氏菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平末端，也可连接粘性末端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度为37，30以下活性明显下降，但考虑到被连接DNA的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平末端连接用20-25，粘端连接用16左右。聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA的大肠埃希氏菌DNA聚合酶，大肠埃希氏菌DNA聚合酶大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希氏菌DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。大肠埃希氏菌DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53 及35外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶作用后产生的一个大片段，有53 聚合酶和53 外切酶活性，无35 外切酶活性。可用于缺口翻译法（nick translation）标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。末端转移酶在Mg2+存在下，选择3-OH端单链DNA为引物加入核苷酸，在Co2+存在下，选择3-OH端双链DNA为引物加入核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾。碱性磷酸酶去除5-P，可防止两分子DNA片段5 端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5 端磷酸基团，在连接酶作用下目的基因的5 端P先与载体3 端OH连接，再通过复制修复另一条链，使两条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图2-1）。图2-1经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接第一节 限制性核酸内切酶及其应用一、限制性核酸内切酶的发现当(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是I型的，没有实用价值。首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5-磷酸二酯键。二、限制性核酸内切酶的分类 分为I型、II型和III型。三、限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体，字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ，流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、Hind III。四、II型限制性核酸内切酶的基本特性1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4-8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端（cohesive ends）：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶（isoschizomers）：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶（isocaudamers）：识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、Bcl I、Bgl II和Xho I 是一组同尾酶。由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。（五）限制性核酸内切酶的消化反应一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：1、DNA的纯度2、DNA的甲基化程度3、酶切反应的温度（通常为37 ）4、DNA的分子结构 5、核酸内切限制酶的缓冲液 在“非最适的”反应条件下，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。第二节 DNA连接酶及其应用一、DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。首个DNA连接酶(ligase)大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。二、DNA连接酶作用特点1、连接的两条链必须分别具有自由3-OH和5-P，而且这两个基团彼此相邻；2、在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。三、DNA连接酶的反应条件影响连接效率的因素有：1、温度（通常在4-15 ）2、ATP的浓度(10 M -1 mM )3、连接酶浓度（一般平末端大约需1-2U，黏性末端仅需0.1U）4、反应时间（通常连接过夜）5、插入片段和载体片段的摩尔比（ 11-51） 四、T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1、连接反应一般在灭菌的0.5 ml离心管中进行。2、10 l体积反应体系中：取载体50-100 ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-51），补足ddH2O 至8 l。3、轻轻混匀，稍加离心，56水浴5 min后，迅速转入冰浴。4、加入含ATP的10Buffer 1 l，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10 l，稍加离心，在适当温度（一般16）连接8-14 h。第三节 DNA聚合酶及其应用一、大肠杆菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E.coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶。（一）大肠杆菌DNA聚合酶I的生物活性包括 3种不同的酶活性：1、5 3聚合酶活性（模板，带3-OH游离基团的引物、4种dNTPs、Mg2+ ）2、双链特异性的53 核酸外切酶活性3、35 核酸外切酶活性从游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被53的多聚活性所抑制。主要是校正作用。（二）大肠杆菌DNA聚合酶I 的用途1、利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针 利用其53的外切酶活性及其聚合酶活性。2、用于DNA连接前的大缺口填充 利用53的聚合酶活性。3、用于DNA的序列分析 利用53的聚合酶活性。二、Klenow片段Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76kD。（一）Klenow片段生物活性酶催活性：（1）53的聚合酶活性 （2）35的核酸外切酶活性（二）Klenow片段的主要用途1、修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端2、标记DNA片段的末端 底物为-32P-dNTPs。3、cDNA克隆中第二链cDNA的合成4、DNA序列的测定三、T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的。（一）T4 DNA聚合酶生物活性1、53的聚合酶活性2、3 5 的核酸外切酶活性其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100-1000倍。因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如