生物化学第五章核酸

会计学1生物化学第五章核酸生物化学第五章核酸核酸核酸脱氧核糖核脱氧核糖核酸（酸（DNA）tRNAmRNArRNA蛋白质合成蛋白质合成一、核酸的发现二、核酸的种类和分布DNA：原核：裸露的原核：裸露的DNADNA分子集中于核区分子集中于核区 质粒质粒DNADNA真核：真核：细胞核细胞核DNADNA：98%98%与组蛋白结合与组蛋白结合 染色体染色体细胞器细胞器DNADNA：一般裸露，环状双链：一般裸露，环状双链RNA：细胞质，参与蛋白质合成：细胞质，参与蛋白质合成rRNA：核仁中合成，占总：核仁中合成，占总RNA的的80% 参与核糖体的构成参与核糖体的构成tRNA：核内合成，占总：核内合成，占总RNA的的15% 携带氨基酸到核糖体携带氨基酸到核糖体mRNA：核内合成，占总：核内合成，占总RNA的的5%， 蛋白质合成的模板蛋白质合成的模板核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷 磷酸磷酸碱基碱基 戊糖戊糖嘌呤碱嘌呤碱嘧啶碱嘧啶碱核糖（核糖（RNA）脱氧核糖（脱氧核糖（DNA）三、核酸的化学组成三、核酸的化学组成组成核酸的组成核酸的碱基碱基l腺嘌呤腺嘌呤l鸟嘌呤鸟嘌呤12l尿嘧啶尿嘧啶l胞嘧啶胞嘧啶l胸腺嘧啶胸腺嘧啶21稀有碱基稀有碱基tRNA中的N6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶l嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。构。戊糖戊糖l组成核酸的戊糖有两种组成核酸的戊糖有两种:DNA:DNA所含的糖为所含的糖为-D-D-2-2-脱氧核糖，脱氧核糖，RNARNA所含的糖则为所含的糖则为-D-D-核糖。核糖。核苷核苷是一种糖苷，由戊糖与碱基缩合而成，糖与碱基之间以糖苷键连接，核苷是一种糖苷，由戊糖与碱基缩合而成，糖与碱基之间以糖苷键连接，称为称为C-NC-N糖苷键糖苷键。根据核苷中所含戊糖的不同，将核苷分成两大类：（碱基）核糖核苷根据核苷中所含戊糖的不同，将核苷分成两大类：（碱基）核糖核苷和脱氧核糖核苷。和脱氧核糖核苷。鸟嘌呤脱氧核苷鸟嘌呤脱氧核苷糖苷键糖苷键糖的第一位碳原子（糖的第一位碳原子（C1）与嘧啶碱的第一位氮原子）与嘧啶碱的第一位氮原子（N1）相连，或与嘌呤碱的第九位氮原子（）相连，或与嘌呤碱的第九位氮原子（N9 ）相）相连。连。胞嘧啶核苷胞嘧啶核苷 腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷核苷酸核苷酸核苷酸是核苷的磷酸酯。作为核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNADNA或或RNARNA结构单元的核结构单元的核苷酸分别是苷酸分别是5-5-磷酸磷酸- -脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5-5-磷酸磷酸- -核糖核糖核苷。核苷。常见的核苷酸及其缩写符号常见的核苷酸及其缩写符号特殊的核苷酸特殊的核苷酸3，5-环化腺苷酸环化腺苷酸3,5-环化腺苷酸（cAMP)，普遍存在于生物细胞内，含量极小，具有放大激素信号的作用。3，5-环化鸟苷酸具有缩小激素信号的作用，cAMP和cGMP被称为第二信使。第二节核酸的分子结构第二节核酸的分子结构DNA的分子结构的分子结构 DNA的一级结构的一级结构 DNA的二级结构的二级结构RNA的分子结构的分子结构 DNA的三级结构 mRNA的结构的结构 tRNA的结构的结构 rRNA的结构连键：连键：3，5-磷酸二磷酸二酯键酯键方向：方向：3-末端末端5-末端末端一、核酸的一级结构一级结构的线条式缩写l在多聚核苷酸中，多聚核苷酸链一端的在多聚核苷酸中，多聚核苷酸链一端的C C5 5带有带有一个自由磷酸基，称为一个自由磷酸基，称为5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 5-P-P表表示）；另一端示）；另一端C C3 3带有自由的羟基，称为带有自由的羟基，称为3-3-羟基羟基端（常用端（常用3 3-OH-OH表示）。表示）。一级结构的文字式缩写nTGCAGGTTAAAGGn它的互补链它的互补链:nACGTCCAATTTCC(误误)nCCTTTAACCTGCA(正正)n3-ACGTCCAATTTCC-5(正正)实验实验1：肺炎链球菌实验：肺炎链球菌实验1928年，英国细菌学家年，英国细菌学家Griffith用肺炎链球菌感染小鼠的实验。用肺炎链球菌感染小鼠的实验。 v 1952年，年，Hershey和和Chase用噬菌体标记的感染实验。用噬菌体标记的感染实验。 实验实验2：T2噬菌体感染实验噬菌体感染实验二、二、DNA的空间结构的空间结构1953年Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构模型DNA的的Na盐纤维和盐纤维和DNA晶体的晶体的X光衍射分光衍射分析。析。 Franklin1.由两条由两条反向平行反向平行的的多核苷酸链围绕同多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕而成一中心轴盘绕而成的的右手双螺旋右手双螺旋2.碱基处于螺旋内侧，碱基处于螺旋内侧，而磷酸及戊糖位于而磷酸及戊糖位于外侧外侧。碱基的平面。碱基的平面与螺旋轴相垂直，与螺旋轴相垂直，糖平面与碱基平面糖平面与碱基平面几乎成直角几乎成直角沿着走向，磷酸、沿着走向，磷酸、戊糖骨架形成深浅戊糖骨架形成深浅不同的凹陷，即大不同的凹陷，即大沟和小沟。沟和小沟。3.螺旋的螺旋的直径为直径为2nm，相邻碱基在，相邻碱基在螺旋轴上间距为螺旋轴上间距为0.34nm，旋转夹角，旋转夹角为为3。每对。每对核苷酸形成螺旋的核苷酸形成螺旋的一圈，一圈，螺距为螺距为.4nm。DNA双螺旋结构的稳定性双螺旋结构的稳定性1. 碱基堆积力碱基堆积力 形成疏水环境（主要因素）形成疏水环境（主要因素）2. 互补碱基对间的氢键互补碱基对间的氢键 G、C含量越多，越稳含量越多，越稳定定3. 静电排斥力静电排斥力 磷酸基上的负电荷与介质中的磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的阳离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。稳定。4. 疏水相互作用疏水相互作用 碱基处于双螺旋内部的疏水碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。DNA，双螺旋，正反向，互补链。A对T，GC连，配对时，靠氢键。十碱基，转一圈，螺旋34点中间。碱基力和氢键，维持螺旋结构坚。nB-DNAnA-DNAnZ-DNA22三股螺旋三股螺旋DNAK. Hoogsteen 1963通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：Py. Pu*Py/Pu当当DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链DNA，hinged DNA , H-DNA)n定义：定义：DNA的的三级结构是指三级结构是指在二级结构的在二级结构的基础上，通过基础上，通过扭曲和折叠所扭曲和折叠所形成的特定构形成的特定构象。象。互绕数互绕数=22螺旋圈数螺旋圈数=20超螺旋数超螺旋数=2nRNA分子一级结构的特点：分子一级结构的特点：n真核细胞真核细胞mRNA分子分子结构特点：结构特点：1.在在3-末端有一段长末端有一段长约约250个残基的聚腺个残基的聚腺苷 酸 （苷 酸 （ P o l y A ）2.真核细胞真核细胞mRNA的的5-末端有一极为特末端有一极为特殊的帽子结构，称为殊的帽子结构，称为“帽子帽子（Cap）”：m7G p p p N mAA.AA200APoly A3-端端5-端端帽子结构非编码区非编码区编码区编码区ntRNA二级结构特点：二级结构特点：1.分子量较小；分子量较小；2.在碱基组成上，有较多在碱基组成上，有较多的稀有碱基；的稀有碱基；3.tRNA的的3-末端，皆末端，皆为为CCAOH；4.5末端多数为末端多数为pG，也，也有有pC.；5.tRNA的二级结构都呈的二级结构都呈三叶草形。三叶草结构三叶草形。三叶草结构由氨基酸臂、二氢尿嘧由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外啶环、反密码环、额外环和环和TC环等五部分组环等五部分组成成。一、核酸的一般性质一、核酸的一般性质二、核酸的紫外吸收性质二、核酸的紫外吸收性质四、核酸的变性、复性和分子杂交四、核酸的变性、复性和分子杂交1.核酸和核苷酸都是两性电解质，在电场中有电泳行为。核酸和核苷酸都是两性电解质，在电场中有电泳行为。 但磷酸基团为多元酸，因此核酸具有较强的酸性，等电但磷酸基团为多元酸，因此核酸具有较强的酸性，等电点较低。点较低。2. 核酸不溶于一般的有机溶剂，但可溶于核酸不溶于一般的有机溶剂，但可溶于 乙醇的水溶液乙醇的水溶液 50% 75%3.核酸溶液有较大的粘度核酸溶液有较大的粘度 双链双链DNA不规则线团不规则线团 DNA RNA碱水解：碱水解： RNA的磷酸酯键易水解产生核苷酸的磷酸酯键易水解产生核苷酸 室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。 DNA的磷酸酯键不易水解的磷酸酯键不易水解 原因：原因：RNA的核糖上有的核糖上有2-OH酸水解：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键最不稳定的是嘌呤和脱氧核糖之间的C-NDNA比RNA易发生酸水解利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。酶水解：酶水解：非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称核酸酶专一水解核酸的磷酸二酯酶称核酸酶根据底物专一性分为：根据底物专一性分为：核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase根据酶对底物作用的部位：根据酶对底物作用的部位： 核酸外切酶（exonuclease) 核酸内切酶 (endonuclease)在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。n碱基、核苷、核苷酸碱基、核苷、核苷酸和核酸在和核酸在250290nm的紫外波段有强烈的的紫外波段有强烈的光吸收光吸收n最大吸收峰：最大吸收峰：260nm1.核酸的变性核酸的变性n变性变性：是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链转：是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链转变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。n变性的实质：变性的实质：二级结构改变（氢键断裂）二级结构改变（氢键断裂），一级结构不变（共价键不断裂）。，一级结构不变（共价键不断裂）。n引起变性的因素：加热、酸、碱、尿素、引起变性的因素：加热、酸、碱、尿素、有机溶剂有机溶剂n变性的性质变化：增色效应、粘度降低、变性的性质变化：增色效应、粘度降低、生物活性部分和全部丧失。生物活性部分和全部丧失。n增色效应增色效应：由于核酸变性而使紫外吸收增加的：由于核酸变性而使紫外吸收增加的现象。现象。nDNA的均一性的均一性 均均一性越高，变性的温度一性越高，变性的温度 范围越窄。范围越窄。nG-C含量：含量：与与Tm成正比成正比Tm = 69.3+ 0.41（G+C）G+C =（Tm-69.3）2.44n介质中的离子强度介质中的离子强度 离子强度低离子强度低DNA的的Tm值值 低，变性过程发生在较宽低，变性过程发生在较宽 温度范围内。温度范围内。n熔解温度（熔解温度（Tm）：通常把加热变性使：通常把加热变性使DNA的双螺的双螺旋失去一半时的温度称为旋失去一半时的温度称为DNA的熔解温度。的熔解温度。q复性复性：热变性的：热变性的DNA，在缓慢冷却后，分，在缓慢冷却后，分开的双链又可恢复为双螺旋结构的过程。开的双链又可恢复为双螺旋结构的过程。q影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：1.DNA的大小的大小DNA片段越大，复性越慢；2.离子强度离子强度盐浓度越高，复性越快3.DNA的浓度的浓度DNA浓度越大，复性越快。q减色效应减色效应：核酸复性时，紫外吸收降低，：核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象称减色效应。称减色效应。热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。核酸的杂交：核酸的杂交：热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时单链，在复性时并不一定与同源并不一定与同源DNADNA互补链形互补链形成双螺旋结构，它也可以与成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异在某些区域有互补序列的异源源DNADNA单链形成双螺旋结构。单链形成双螺旋结构。琼脂糖电泳用于大片段琼脂糖电泳用于大片段DNA的分离，精度低，的分离，精度低，但分离范围广但分离范围广影响迁移率的因素：核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 浓度大，孔径越小。 DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/ml EB核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳n基本知识：基础性的框架知识n核酸的结构：DNA、tRNA和mRNAn核酸的性质RNA：细胞质，参与蛋白质合成：细胞质，参与蛋白质合成rRNA：核仁中合成，占总：核仁中合成，占总RNA的的80% 参与核糖体的构成参与核糖体的构成tRNA：核内合成，占总：核内合成，占总RNA的的15% 携带氨基酸到核糖体携带氨基酸到核糖体mRNA：核内合成，占总：核内合成，占总RNA的的5%， 蛋白质合成的模板蛋白质合成的模板核苷核苷是一种糖苷，由戊糖与碱基缩合而成，糖与碱基之间以糖苷键连接，核苷是一种糖苷，由戊糖与碱基缩合而成，糖与碱基之间以糖苷键连接，称为称为C-NC-N糖苷键糖苷键。根据核苷中所含戊糖的不同，将核苷分成两大类：（碱基）核糖核苷根据核苷中所含戊糖的不同，将核苷分成两大类：（碱基）核糖核苷和脱氧核糖核苷。和脱氧核糖核苷。鸟嘌呤脱氧核苷鸟嘌呤脱氧核苷一级结构的文字式缩写nTGCAGGTTAAAGGn它的互补链它的互补链:nACGTCCAATTTCC(误误)nCCTTTAACCTGCA(正正)n3-ACGTCCAATTTCC-5(正正)22碱水解：碱水解： RNA的磷酸酯键易水解产生核苷酸的磷酸酯键易水解产生核苷酸 室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。 DNA的磷酸酯键不易水解的磷酸酯键不易水解 原因：原因：RNA的核糖上有的核糖上有2-OHq复性复性：热变性的：热变性的DNA，在缓慢冷却后，分，在缓慢冷却后，分开的双链又可恢复为双螺旋结构的过程。开的双链又可恢复为双螺旋结构的过程。q影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：1.DNA的大小的大小DNA片段越大，复性越慢；2.离子强度离子强度盐浓度越高，复性越快3.DNA的浓度的浓度DNA浓度越大，复性越快。q减色效应减色效应：核酸复性时，紫外吸收降低，：核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象称减色效应。称减色效应。