利用重组OGDC-E2检测M2抗体及其临床意义(一)

利用重组 OGDC-E2检测 M2 抗体及其临床意义 (一)作者：陈燕，姚定康，周晔，朱烨，蒋廷旺，邓安梅仲人前【关键词】 OGDC-E2检测【摘要】目的重组表达人 OGDC-E2融合蛋白，并用于检测自身抗体。方法重组表达的 OGDC-E2，分别采用免疫印迹法（ IBT）法和酶联免疫吸附试验（ ELISA）方法检测 PBC患者的 M2 抗体。 50 例确诊的 PBC患者为 PBC组，以其他肝病患者 70 例、自身免疫病患者 70 例和健康体检者 70 例作对照。结果 50 例确诊的 PBC患者中 41 例 OGDC-E2抗体阳性， 9 例阴性，阳性率为 82.0%。而疾病对照组和健康体检者血清中 M2 抗体检测均为阴性。结论用重组人 2-氧戊二酸脱氢酶复合物 E2 亚单位检测 M2 抗体，有较好的敏感性及一定的特异性，有助于临床对PBC的诊断。【关键词】2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2 亚单位；原发性胆汁性肝硬化；免疫印迹法；酶联免疫吸附试验；自身抗体Detectionofanti-M2autoantibodyusingrecombinantOGDC-E2【Abstract】ObjectiveTodetectthelevelofanti-M2autoantibodyusingrecombinantOGDC-E2.MethodsWepurifiedrecombinantOGDC-E2byNi2+affinitychromatographycolumnandthenestablishedWesternblottingtest(WBT)andenzymelinkedimmunosorbentassays(ELISA)todetectanti-M2autoantibodyintheseraofpatientswithprimarybiliarycirrhosis(PBC).ResultsAmong50serafromPBCpatients,41werepositive,allofcontrolswerenegative.ConclusionTherecombinantOGDC-E2couldbeusedtodetectanti-M2autoantibodyspeciallyandsensitively,helpfulfordiagnosisofPBC.【Keywords】OGDC-E2;primarybiliarycirrhosis;immunoblotting;enzymelinkedirnmunosorbentassay;autoantibody原发性胆汁性肝硬化（primarybiliarycirrhosis,PBC)是一种自身免疫性疾病，主要表现为肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致肝纤维化及肝硬化1。高滴度的抗线粒体抗体（AMA）是本病的特征，而 M2 又是 PBC的特异性抗体。2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC-E2）为 M2 的靶抗原的组分之一。OGDC-E2的抗原表位位于内酯酰区，在PBC患者血清中的阳性率为39%88%2，3。笔者采用免疫印迹法（IBT）和酶联免疫吸附试验 （ELISA），探讨用重组抗原OGDC-E2检测 M2 抗体在 PBC诊断中的应用价值，为PBC的早期发现和临床诊断提供依据。1 材料和方法1.1 研究对象 2003 年 4 月2005 年 8 月在我院就诊并被确诊为PBC的患者 50 例为观察对象（ PBC组），其中男 3 例，女 47 例，男女比例为116。年龄 4269 岁。以 2005 年间在我院就诊的其他肝病患者70 例、自身免疫病患者 70 例、健康体检者 70 例作对照。1.2 诊断标准 PBC的诊断符合 2000 年美国肝脏病学会 （AASLD）推荐的诊断指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变 （主要是碱性磷酸酶、 -谷胺酰转肽酶升高） 且无其他原因解释；血清抗线粒体或 M2 抗体阳性；同时 AMA1404。 1.3 方法重组抗原纯化将特异性扩增 OGDC-E2cDNA并定向插入高效表达载体 PET28a(+），转导入宿主菌，经 IPTG诱导后表达，在变性条件下用带 6 个组氨酸的 Ni-NTA 琼脂糖纯化，获得高纯度的重组OGDC-E25。重组融合抗原 IBT侧 M2 抗体将重组蛋白OGDC-E2经 SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的 PBS（pH7.4）封闭 1h；而后依次加入血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗人 IgG 抗体，加入3，3-二胺联苯胺溶液和30%H2O2，观察反应条带。同时用正常人血清作阴性对照。测 M2 抗体重组融合抗原OGDC-E2包被微孔板，首次将血清作 115 稀释进行常规 ELISA检测，测 A450nm。对超过 1 个 A450nm值者继续作系列稀释。设相应的血清稀释液抗原抗体，反应产物在450nm 产生的 1 个吸光度 A 值为 1 个抗体单元（ U），各样品抗体单位为 A 值数字 X 稀释倍数。1.4 统计学方法用 Students 检验分析组间差异。