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第三章 蛋白质的共价结构一、蛋白质通论(一)、蛋白质的化学组成 碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3% 其它微量元素(包括磷,金属元素等,这些是蛋白质的辅助成份或修饰成份)在这些化学元素中,氮的含量在不同蛋白质中很稳定,所以可以根据氮元素的含量测定蛋白质的含量:蛋白质含量蛋白质氮 6.25这是蛋白质定量分析的理论基础,经典的蛋白质含量测定方法就是先测定蛋白质氮的含量,再根据上述公式计算蛋白质的含量。 (二)、蛋白质的分类(三)、蛋白质的形状和大小 蛋白质的大小与分子量 蛋白质的分子量变化较大,从6000到1,000,000道尔顿(dolton)。蛋白质的分子量可以通过实验予以测定,通常也可根据氨基酸的数目估计: 蛋白质的分子量(dolton)氨基酸残基数110 但对于结合蛋白上述公式不适应。蛋白质的结构层次一级结构: 氨基酸序列二级结构: 螺旋,折叠三级结构: 所有原子空间位置四级结构: 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构(二级结构的组合)和结构域(在空间上相对独立)这两个层次。(五)蛋白质的功能 1.酶2.结构成分3.氨基酸的贮藏 4.运输功能 5.运动 6.激素 7.免疫 8.信息传递 9.基因表达调控 二、肽由氨基酸聚合而成的线性结构叫肽链(peptide chain),蛋白质就是由一条或多条肽链组成。蛋白质的共价结构也即是肽链的结构。蛋白质的共价结构有时也称一级结构。但根据IUPAC的规定蛋白质的一级结构指肽链的氨基酸顺序。 (一)、肽和肽键的结构 1.蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的多肽链分子,肽键是它的连接方式。蛋白质一级结构中的另一种共价结构是二硫键。它使同一条链内或两条链间的两个巯基形成二硫键。 2.肽键的结构 3.有关肽的名称 多肽,环肽,阅读方向,氨基酸残基 4.肽键的性质 刚性,反式 肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连残基:在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子,脱水后的残余部分叫残基(residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。(二)肽的物理与化学性质 1.带电性短肽:酸碱性由末端的氨基和羧基和R基团的可解离基团决定,滴定曲线相似于氨基酸的滴定曲线。其中氨基的pK值较游离氨基酸小,羧基的pK值较游离羧基大,R-基团变化不大。长肽或蛋白质中酸碱性由R-基团决定。电荷计算:根据R基团在某一pH值时的解离状态确定;等电点计算:同样,先写解离式,再根据pK值进行计算。 2.化学性质氨基,羧基和R基团与游离氨基酸一样,同样有茚三酮反应,还有肽键特有的反应双缩尿反应。 3.旋光性短肽为各氨基酸的旋光度的综和,而长肽不等于其总和。 (三)、天然肽有许多种生物活性:激素,抗生素等。肽激素,鹅膏蕈碱,谷胱甘肽。 三、蛋白质一级结构测定(一)、氨基酸序列分析的基本策略重叠法(二)、蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化 2、测定多肽链的数目 3、(亚基分离) 4、二硫键的拆分与保护 5、氨基酸组成分析 6、鉴定N-或C-末端残基7、多种方法的部分水解和肽段分离 8、测序 9、重叠 10、确定二硫键的位置 1.N-末端测定(1)二硝基氟苯(DNFB or FDNB)法;(2)丹黄酰氯(DNS)法;(3)苯异硫氰酸酯(PITC)法;(4)氨肽酶(amino peptidase)法2.C-末端测定(1)肼解法(hydrazinolysis)法;(2)还原法(reduction);(3)羧肽酶(Cardoxypeptidase)法3.二硫键的切割与保护1、过甲酸performic acid 不可逆 CH2SO3H2、亚硫酸分解Sulfitolysis 可逆 R1-S-S-R2 SO3- R1-S- + R2-S-SO33、还原氧化 不可逆 巯基乙醇,DTT 碘乙酸等 S-CH2-COOH4.氨基酸组成分析 1.酸水解; 2.碱水解; 3.氨基酸分析5.肽键的专一性水解酶水解化学法: BrCN,NH2OH 酶法水解6.N末端和C末端测序法N末端:1、Sanger法 DNFB2、Edman法3、Dansyl chloride/Edman组合法4、酶降解法C末端:1、肼法2、3H标记法3、酶降解法 4、PFPA/PFPAA法C末端的肼(hydrazine)法测定C端的氚3H标记法测定酶解法末端测序 利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来,在不同时间取样进行分析,根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。PFPA和PFPAA法C端测序PFPA:pentafluoropropionic acid C2F5COOHPFPAA:Pentafluoropropionic acid anhydride C2F5-COOOC-C2F5 这两种物质在酸性条件下低温反应,可以从C端一个接一个地切除氨基酸,与质谱相结合就可以确定C端多个氨基酸的序列。7.肽段氨基酸序列的测定Edman 降解法氨基酸的鉴定、分离纯化Edman降解与DNS-Cl法的结合其它方法:1.酶解法2.质谱法3.根据核苷酸序列推断质谱法 Edman循环后看分子量的变化7.二硫键位置的确定法1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应,先 将自由SH基封闭。2、进行专一性部分水解3、纸层析分离水解产物4、气相过甲酸法切断S-S键,作第二相纸层 析5、将迁移率发生变化的多肽进行测序 N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外,最常用于基因工程表达产物的末端分析。四、蛋白质氨基酸序列与生物学功能的关系(一)同源蛋白质的物种差异与生物进化1.蛋白质的同源性(sequence homology)2.不变残基(invariant residue)3.可变残基(varible residue)(二)同源蛋白质的起源共同性(三)蛋白质断裂与激活第三章 蛋白质的三维结构 蛋白质的一级结构不具有功能,只有形成正确的结构才具有功能。二级结构以上的结构叫高级结构,由于高级结构是指各原子或基团在空间上的分布,所以又叫空间结构,或三维结构。一、蛋白质的二级结构(一)维持蛋白质空间构象的作用力作用力 破坏因子氢键: -螺旋,-折叠 尿素,盐酸胍疏水作用: 形成球蛋白的核心 去垢剂,有机溶剂Van der Waals力:稳定紧密堆积的集团和原子离子键:稳定-螺旋,三、四级结构 酸、碱二硫键:稳定三、四级结构 还原剂配位键:与金属离子的结合 螯合剂 EDTA(二)影响蛋白折叠的因素1.二面角的转动2.非键合原子之间的最小接触距离3.侧链基团的空间位阻、电荷性质、基团间的相互作用等二、典型的二级结构1.螺旋右旋,3.6个氨基酸一个周期,螺距0.54 nm第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键,环内原子数13。氢键取向与主轴基本平行1.- 螺旋的结构特征: = -57o ;=-47o ; 3.613-螺旋 螺距=5.4;每个氨基酸上升1.5 ,直径=5 2. - 螺旋的偶极矩和帽化 3. - 螺旋的手性 - 螺旋都是右手的,其旋光性是- 碳原子的不对称性与- 螺旋的构象不对称性的结合。 4.影响- 螺旋的形成的因素: pH 的影响 一级结构与二级结构的关系(空间位阻,电荷效应,特殊结构,如脯氨酸)。2. 折叠折叠旋的结构特征: = 139o ;=135o (反平行折叠) 主要存在于球状蛋白和纤维蛋白中 = 119o ;=113o (平行折叠) 主要存在于球状蛋白 折叠较为伸展。3.转角半圈3.010 螺旋-凸起4、无规卷曲(randon coil) 指那些没有明确重复周期结构的“卷曲结构”,它并非是“无规”卷曲,而是有序的非重复结构。这些无规卷曲结构常常构成蛋白质的活性结构部位和特异功能部位。三、纤维状蛋白功能:动物支架蛋白,占一半或一半以上。分子轴比大于10,分类:不可溶和可溶两种:前者包括角蛋白,胶原蛋白,后者包括肌球蛋白和纤维蛋白原。注意,有的象纤维状的蛋白是球状蛋白的长轴方向的聚集体不是纤维蛋白。-角蛋白 存在 分类 结构 特性: 伸缩性螺旋圈间的氢键 刚性链间二硫键(含硫量)-角蛋白存在结构:反平行-折叠片,多肽链呈锯齿状折叠构象,侧链交替的分布在折叠片两侧; 主要由具有Gly、Ser、Ala组成。作用力:链间以氢键连接 层间以范德华力维系特性: 抗张性 柔软性 不能拉伸(二)胶原蛋白Collagen的特殊性胶原蛋白的要点:1.胶原的组织分布和类型2.胶原的氨基酸组成3.胶原蛋白的结构4.稳定胶原蛋白结构的作用力稳定胶原三股螺旋的作用力: 层间的范德华作用力; 螺旋链间氢键; 链间的共价交联 赖氨酸间的交联 吡啶啉结构。(三)弹性蛋白(四)肌球蛋白四、蛋白质的超二级结构超二级结构的类型:keratin, myosin, 、:拥有-sheet的蛋白质形成超二级结构的作用力: 螺旋的侧链位置的20度错位:伸展肽链的12.5度自然扭曲六、蛋白质的结构域结构域(domain)在空间上相对独立七、球状蛋白质三级结构(一)球状蛋白的分类(二)球状蛋白三维结构的特征1.球状蛋白分子含有多种二级结构元件2.球状蛋白具有明显的折叠层次3.球状蛋白分子为紧密的球状或椭球状实 体4.球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内部,亲 水侧链暴露在分子的表面5.球状分子的表面有沟穴。八、膜蛋白的结构(一)生物膜的结构(二)膜内在蛋白的结构1.单跨膜肽段的膜蛋白2.具有7个跨膜肽段的膜蛋白3.桶型膜蛋白膜孔蛋白(三)脂锚定蛋白九、蛋白折叠和结构预测(一)蛋白质的变性 蛋白质的变性是指蛋白质空间结构发生改变,活性丧失的现象。 变性不是降解(分解)1.变性的表现:(1)活性丧失;(2)一些侧链基团的暴露,侧链基团的化学反应特性发生改变;(3)理化性质发生改变;(4)生化性质发生改变。2、引起变性的因素(1)物理因素:光、热、射线、高压、表面张力等;(2)化学因素:变性剂,去污剂,重金属等。3、变性的本质 变性是蛋白质分子高级结构的变化,主要是三级结构,二级结构的改变。 蛋白质分子的结构是一个柔性、动态的结构,这种动态的结构在活性范围内变化,不会引起活性的变化,而超过允许的范围,次级键发生改变,蛋白就变性。4.蛋白质变性的可逆性 蛋白质变性后,消除变性因素后,蛋白质可恢复其活性的变性叫可逆变性。 蛋白质变性后,消除变性因素后,蛋白质不能恢复其活性的变性叫不可逆变性。二、一级结构对高级结构的规定性蛋白质的一级结构决定高级结构 结论:蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之,蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。 (三)、蛋白质的折叠1.蛋白折叠研究的现状:多数是采用体外变性/复性过程研究折叠过程,而这种过程与体内过程是不一样的。所以这一研究方法本身存在缺陷。2.异构酶和分子伴侣在体内蛋白质折叠中的作用 在一部分蛋白质中,其正确的空间结构的形成需要一些辅助蛋白的作用,这些辅助蛋白即是异构酶和分子伴侣。 蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerse PDI),其作用是加速二硫键的形成; 肽基脯氨酸异构酶(peptidyl prolyl isomerse),其作用是帮助脯氨酸的顺反异构过程。 分子伴侣(molecular chaperone)的作用是帮助肽链的正确折叠。(四)蛋白质结构预测1.二级结构预测2. 三级结构的预测(1)同源蛋白质结构预测(2)能量最小原则预测(3)“局部”和“分层”方法LINUS预测方法结构预测的意义:对于新的功能基因的研究,通过结构预测,推断其可能的功能,为进一步开展其功能研究奠定基础。十、亚基的缔合和四级结构(一)名称: 1.四级结构:多个亚基缔合形成聚集体即四级结构; 2.亚基(单体 monomer):一条多肽链形成的球状蛋白结构; 3.原(聚)体(protomer):对称的寡聚蛋白质分子是由两个或多个不对称的等同结构组成,这种等同结构成分称为原体; 4.寡聚体:两个以上的亚基组成的蛋白质; 5.同多聚体(homomultimeric) :相同亚基 6.杂多聚体(heteromultimeric) :不同亚基(二)四级结构的作用力和作用方式所有三级结构的作用力,在四级结构形成中都有作用; 同种缔合:相同表面间的缔合; 异种缔合:不同表面间的缔合(三)蛋白四级结构的对称性点群对称环状对称:只有一个对称轴;立方体对称:2个以上的对称轴,根据对称轴的多少,分别有二面体对称;四面体对称;八面体对称,二十面体对称。螺旋体对称: 对称点绕轴旋转的聚合形式。四、四级缔合在结构和功能上的优越性1.增强结构的稳定性:缔合降低总表面积,使得结构更稳定2.遗传经济性:一个基因编码的蛋白可组成同多聚体。3.使催化基团汇集在一起,提高催化效率4.具有协同效应和别构效应多亚基蛋白的别构效应 蛋白质与配基结合改变蛋白质构象, 进而改变蛋白质生物活性的现象称为别构效应。 同促效应 (homotropic effect) 指配体的结合对其它同种配体的效应; 异促效应(heterotropic effect) 指配体的结合对其它异种配体的效应; 正效应物(activator),使其它配体与结合部位结合能力加强(饱和浓度降低)。 负效应物(inhebitor),使其它配体与结合部位结合能力减弱(饱和浓度提高)。 第五章 蛋白质结构与功能 蛋白质在与其它分子的相互作用中行使其生物功能。在蛋白质与其它分子的相互作用中能被它可逆结合的其它分子称为配体。 氧的转运肌红蛋白、血红蛋白的结构与功能 免疫应答免疫球蛋白的结构与功能 肌肉收缩 肌球蛋白(粗丝)、肌动蛋白(粗丝)与肌肉收缩 蛋白质的结构与功能进化一、胰岛素的结构与功能一级结构:A链和B链组成,A链21AA,B链30AA,二级结构:A链A12-A15是非标准的右手螺旋,其他为不同伸展程度的肽链结构;B链在B1B6是伸展结构,B8为Gly,转折进入螺旋结构,B9-B19为右手螺旋,其中两圈为标准的螺旋。B21-23间有一回折。B23-B27间为一折叠。分子内部为非极性的疏水核,全部极性侧链在表面上。在表面有一个疏水区,在疏水区表面周围有带电荷基团或极性基团。其中疏水区的芳香环除了具有疏水作用外,可能还与受体的识别有关。胰岛素的这个表面结构可能与其作为配体的作用有关。二、肌红蛋白的结构与功能存在:Sperm whale (抹香鲸, 巨头鲸) myoglobin (肌红蛋白), the oxygen carrier in muscle, was the first protein to be seen in atomic detail by X-ray analysis (John Kendrew, 1950s)功能:肌细胞储存和分配氧的蛋白质(一)肌红蛋白的三级结构组成:珠蛋白和血红素大小和形状:扁平状分子,4.5nm3.5nm2.5nm结构描述:153个aa,8段-螺旋组成,分两层,单结构域。分子结构紧密,内部只能容纳4个水分子的空间。疏水基团在分子的内部,亲水基团在分子表面,介于疏水和亲水之间的基团在分子内部和外部都可以找到。(二)辅基血红素由4个吡咯环通过甲基桥连接成原卟啉IX,另外有4个甲基,2个乙烯基和2个丙酸基。原卟啉IX与Fe形成络合物,即是血红素。Fe有6个配位键,其中4个键与卟啉环的4个N原子相连,第5配位键与His F8相连,第6配位键与O2相连。 如果血红素含Fe2+,为亚铁血红素,Fe3+,为高铁血红素。相应的肌红蛋白分别为亚铁肌红蛋白和高铁肌红蛋白。(三)O2与肌红蛋白的结合 Fe的第六配位键在没有O2时,是空着的,O2与肌红蛋白中的Fe 结合,结合以后与Fe-O键形成60度的夹角,同时夹在远侧组氨酸的中间。 除了O2与Fe结合外,CO也会与Fe结合,导致CO中毒。 肌红蛋白的微环境的作用: 1.固定血红素; 2.保护血红素Fe不被氧化; 3.为分子氧提供一个合适的结合部位。O2与血红素Fe结合后,会改变肌红蛋白的构象没有结合氧时,铁卟啉处于凸出位置,并且Fe是圆顶状,结合氧后铁卟啉收回形成平面状。(四)氧结合曲线肌红蛋白的功能肌细胞中储存和分配氧的蛋白质。静脉血中氧浓度为15torr 线粒体中0-10torr 肌红蛋白的P50为2torr三、血红蛋白的结构与功能血液中结合和转运氧的蛋白质。还可运输H+和CO2(一)结构4条多肽链,两条为 链,两条链,每个亚基都有一个血红素分子,具有氧结合能力。人在不同的发育阶段有不同的种类。 链和链的三级结构与肌红蛋白相似。 四个亚基形成对称结构。(二)氧结合引起的血红蛋白构象变化1.氧结合改变Hb的四级结构2.血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换3.氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态,氧合后导致盐键断裂,结构变得松弛。(三)血红蛋白的协同性氧结合(四) H+,CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响1.玻尔效应及其意义2.BPG降低Hb对O2的亲合力的机制及意义(1)Bohr效应HbO2 + H+ HbH+ + O2玻尔效应是因为H+促进盐键的形成,使血红蛋白转变成T态,有利于氧的释放。在组织中,CO2浓度高,pH低,有利于氧的释放,在肺组织中,p(O2)高,有利氧的结合。Bohr效应的生理意义在同样氧分压差下,血红蛋白在代谢迅速的组织中放氧量更大。血红蛋白还通过Bohr效应转运走组织中形成的H+和CO2血红蛋白的功能血红蛋白除了运输氧和CO2外,还能够对血液的pH起缓冲作用。因为HbO2在释放出一分子氧的同时,结合一个氢质子。这样就可以消除由于呼吸作用产生的CO2引起pH的降低。肌红、血红蛋白的结构与功能比较肌红蛋白肌细胞中储存和分配氧的蛋白质。属于珠蛋白一族组成: 1条多肽链(珠蛋白)1个辅基血红素结构描述:最高结构为三级结构。 血红蛋白血液中结合和转运氧的蛋白质。 还可运输H+和CO2属于珠蛋白一族4条多肽链(两种亚基) 4个辅基血红素结构描述:四级结构呈四面体 属于点群对称(五)血红蛋白的分子病四、免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体(antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质,主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合,具有免疫功能。(一) 免疫反应的基本概念当外源的分子(蛋白或细胞表面分子)进入哺乳动物体内,与淋巴细胞接触,会产生一种免疫球蛋白,当这种分子再次进入肌体,就会被这种免疫球蛋白的识别,并动员相关的免疫系统清除这种分子(及细胞)。这种外源分子即为抗原;识别这种抗原的免疫球蛋白叫抗体。(二)免疫球蛋白的结构(三)免疫球蛋白的种类及功能人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同,分为五类:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,其重链分别为:、轻链可分为两型:、型IgG于出生后3个月开始合成IgG多为单体,半衰期约为23天,占血清免疫球蛋白总量的75%80%结合补体,激活补体的传统途径 IgG是唯一能通过胎盘的抗体,穿过胎盘介导新生儿抗感染免疫 结合巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞,参与调理吞噬和ADCC效应 与葡萄球菌A蛋白(SPA)结合,可以纯化抗体,也可以用于免疫诊断 抗感染的主要抗体。抗菌抗体、抗病毒抗体、抗毒素抗体IgM为五聚体,是分子量最大的Ig,称巨球蛋白。激活补体能力比IgG强天然血型抗体是IgMIgM是个体发育过程最早能产生的抗体,胚胎晚期已能合成,新生儿脐带血中若IgM水平升高,表示该儿曾有宫内感染 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体,故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断。 IgM是B细胞抗原受体的主要成分IgA分为血清型和分泌型两种,血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生。分泌型IgA(SIgA)是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生。主要存在于初乳、唾液、泪液,以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜IgD单体形式存在血清中,含量低,仅占血清总Ig的1%;IgD是B细胞的重要表面标志B细胞的分化过程中首先出现SmIgM,后来出现SmIgD,他的出现标志着B细胞成了,参与B细胞的活化、增殖和分化 。IgE又称亲细胞抗体CH2和CH3功能区可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fc受体结合,引起敏反应(四)免疫检测应用肌肉收缩的机制:肌丝滑动模型ATP水解与肌动蛋白与肌球蛋白的缔合和解离相偶联。六、蛋白质的结构与功能的进化 生物的形态和分子结构在进化过程中不断向多样化和专业化方向发展。这种多样化是指群体的多样化,专一化是个体的专一化。这种多样化和专一化的基础是分子变异。这种变异通过自然选择,进行多样化和专一(业)化。 新的蛋白质是在旧的蛋白质基础上经过突变,遗传,自然选择产生和发展起来的。第五章 蛋白质的理化性质与分离和纯化蛋白质的理化性质与分离方法 蛋白质溶液胶体性质 沉淀 特定的空间构象,分子量一定 分子筛层析; 在大部分pH条件下,蛋白质分子同时存在两种电荷 等电点沉淀,盐溶,盐析,电泳,离子交换层析等; 一般而言,蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域 有机溶剂沉淀,疏水层析一、蛋白质的理化性质(一)蛋白质的酸碱性质 1.蛋白中的解离基团 2.等电点 3.等离子点 蛋白质与多肽一样,能够发生两性离解,也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI),蛋白质的溶解度最小,在电场中不移动。 在不同的pH环境下,蛋白质的电学性质不同。在pH小于等电点的溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动;在pH大于等电点溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。(二)蛋白质分子的大小和形状 蛋白质的大小从60001000000 Dalton 不同的蛋白质常常有不同的分子量; 蛋白质的形状:球状和纤维状,不同的蛋白质的长短轴比值也有差异。这些差异也是进行分离纯化的依据。(三)蛋白质的胶体性质 由于蛋白质的分子量很大,它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质,如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 蛋白质分子的直径在胶体的范围内; 蛋白质胶体溶液稳定的因素: (1)直径1-100nm; (2)表面带有同种电荷; (3)溶剂化层。(四)、蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件,将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下,蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 消除稳定蛋白质的几个因素,就会导致蛋白质沉淀。通常进行蛋白质沉淀的方法有以下几种: (1)盐析; (2)有机溶剂沉淀法; (3)重金属沉淀; (4)生物碱试剂或某些酸类; (5)加热变性沉淀 前两种方法可以使蛋白质不变性,后3种方法通常会使蛋白质变性。可逆沉淀 在温和条件下,通过改变溶液的pH或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中,结构和性质都没有发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化,所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。(五)、蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素,能够破坏蛋白质的结构状态,引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。变性蛋白质通常都是固体状态物质,不溶于水和其它溶剂,也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以,蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。(六)、蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此,大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质,可以对蛋白质进行定性鉴定二、蛋白质研究技术蛋白质分析的基本技术 1.离心技术 2.层析技术 3.电泳技术 4.沉淀技术 (一)离心技术 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备,生物样品悬浮液在高速旋转下,由于巨大的离心力作用,使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,从而与溶液得以分离,而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。基本原理 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时,此离心力“F”由下式定义,即: F = ma =m.V2/r= m2 r a 粒子旋转的加速度, m 沉降粒子的有效质量,粒子旋转的角速度, r粒子的旋转半径( cm )。离心机的主要构造和类型 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。 实验用离心机又分为: 制备性离心机:制备性离心机主要用于分离各种生物材料,每次分离的样品容量比较大. 分析性离心机:一般都带有光学系统,主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质,依据待测物质在离心场中的行为(用离心机中的光学系统连续监测),能推断物质的纯度、形状和分子量等。 分析性离心机都是超速离心机。 工业离心机:主要用于工业上的分离。 制备性离心机可分为三类: 普通离心机:最大转速6000 rpm左右,最大相对离心力近6000g,容量为几十毫升至几升, 高速冷冻离心机:最大转速为2000025000rpm(r/min),最大相对离心力为89000g,最大容量可达3升, 超速离心机:转速可达5000080000 rpm,相对离心力最大可达510000g,最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等,离心容量由几十毫升至2升(二)层析技术层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography),它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱,并继续以石油醚淋洗,由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。蛋白质分离纯化中应用的层析 分子筛层析 离子交换层析 亲和层析 疏水/反相层析 物理吸附层析分子筛层析 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出;而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。 高效液相色谱技术 (HPLC) 高效液相色谱(HPLC:High Performance Liquid Chromatography )与普通的色谱技术不同的是:填料密度高,洗脱液压力加大,分离效果更好。是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。 高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精度高,应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。 其缺点是:价格昂贵,要用各种填料柱,容量小,分析生物大分子和无机离子困难,流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 (三)电 泳 技 术 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。2.电泳的分类电泳按其分离的原理不同可分为: 区带电泳:电泳过程中,待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带,这是当前应用最为广泛的电泳技术。 自由界面电泳: 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,是在形管中进行电泳,无支持介质,因而分离效果差,现已被其他电泳技术所取代。 等速电泳:需使用专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各电泳区带相随,分成清晰的界面,并以等速向前运动。 等电聚焦电泳:由两性电解质在电场中自动形成pH梯度,当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。(5)脉冲电泳:通过改变电场方向和强度,从而提高大分子的分离效果。(6)毛细管电泳:将介质填充在毛细管中,因散热效果较好,可用高电压进行电泳。按支持介质的不同可分为: 纸电泳(Paper electrophorisis) 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis) 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。按支持介质形状不同可它为: 薄层电泳 ; 板电泳 ; 柱电泳。 按用途不同可分为: 分析电泳; 制备电泳; 定量免疫电泳; 连续制备电泳。 按所用电压不同可分为: 低压电泳:100V500V,电泳时间较长,适于分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳:1000V5000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。4.几种常见的蛋白电泳方法1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳. 2.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳3.等点聚焦电泳 4.双向电泳2.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 主要的分离介质是聚丙烯酰胺凝胶。电泳分两段进行,开始是浓缩胶,其作用是使得蛋白质被压缩成很薄的薄层,使被分离的分子间尽可能地缩短距离。然后进入分离胶进行分离。 三种效应: 样品浓缩效应 分子筛效应 电荷效应电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。浓缩胶 pH 6.8: Gly- protein- Cl-分离胶 pH 8.9: protein- Gly- Cl-4. 双向凝胶电泳 (2D-Page)2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 (四)沉淀技术 蛋白质的沉淀是蛋白质分离的一种方法之一,由于其方法和设备简单,费用低,常常是蛋白质分离中的初分离所采用的方法。 蛋白质沉淀一方面由于不同蛋白质的溶解性质不同,利用其溶解特性的差异进行初分离不同的蛋白;另一方面通过沉淀也是一种浓缩的方式。 蛋白质沉淀的原理是消除蛋白质在水溶液中的稳定条件,即减少同种电荷;消除水化层。蛋白质沉淀的方法有两种: 中性盐沉淀法 有极溶剂沉淀法常用中性盐沉淀法硫酸铵法 溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下(04)进行。(NH4)2SO4在0时仍有70.6的溶解度,远远高于其它盐类。 分离效果好:有的提取液加入适量硫酸铵盐析,一步就可以除去75的杂蛋白,纯度提高了四倍。 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用23mol/L的(NH4)2SO4保存可达数年之久。 价格便宜,废液不污染环境。硫酸铵沉淀蛋白质主要与盐浓度有关,硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示,称为百分饱和度,而不用实际的克数或克分子数,这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时,会出现相当大的非线性体积变化。有极溶剂沉淀法 有机溶剂多采用乙醇和丙酮,其作用原理是乙醇或丙酮能吸收水分子,使溶液中的水势(水势与水占溶液的浓度比成正比)降低,进而减少蛋白质表面的水化层厚度,导致蛋白质溶解度降低。 有机溶剂沉淀也可以通过浓度梯度调整使不同的蛋白质分级沉淀。 有极溶剂沉淀时要注意浓度要逐渐增加,同时多在低温下进行。三、蛋白质的分离蛋白质分离的特点:1.生物材料中的蛋白质种类复杂;2.含量常常比较低;3.易于失活,过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活,所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。 4.生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断,因而实验结果常有很大的经验成份,实验的重复性较差,个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。生物大分子的制备通常可按以下步骤进行:确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发还是要发现新的物质。建立相应的可靠的分析测定方法,这是制备生物大分子的关键,因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。生物材料的破碎和预处理,溶剂系统的选择。分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的过程。生物大分子制备物的均一性(即纯度)的鉴定,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。产物的浓缩,干燥和保存。 蛋白质分离纯化的具体方法初提 精纯化 盐析 离子交换层析 有机溶剂沉淀 分子筛层析 等电点沉淀 疏水/反相层析 结晶 亲和层析四、蛋白质分子量的确定方法 化学组成法: 最低M=元素分子量 /元素百分含量 渗透压法: M=cRT/ 超离心法: M=RTs/(1-)D 凝胶过滤: v=k + clogM SDSPAGE法: d=k + clogM 氨基酸序列分析计算五、蛋白质的定量法 克氏(Kjeldahl)定氮法:浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法:考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可蛋白质紫外吸收定量计算 光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k, 消光系数; c, 摩尔浓度; l, 样品池长度; I, 光强度 对混合蛋白质样品, 1 OD280nm 1 mg/ml 对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A=(5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw,Ny和Nc分别为Trp,Tyr和Cys的数量, M为分子量; Scopes的经验公式: A2051 mg/ml = 27 + 120 (A280/A205) 蛋白质也可以下列经验公式定量: Protein concentration(ug/ml) = 144 (A215 -A225) 有核酸混入时, 有三种近似计算法: Protein concentration (mg/ml) = 1.55A280 - 0.76A260 Protein concentration (mg/ml) = (A235 -A280)/2.51 Protein concentration (mg/ml) = 0.813A230 - 0.0758A260
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