重组DNA技术00002

第二章第二章重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验:从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA；J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型（1953年）M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年）F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年）F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年）M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年）1972年，P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖)1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品-人胰岛素1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。相关概念相关概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系主要内容：主要内容：第一节第一节、重组、重组DNA技术相关概念技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology 克隆克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）是在体外体外将不同来源的特异基因或特异基因或DNADNA片片段段插入病毒、质粒或其它载体载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细受体细胞胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。DNA克隆克隆 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因克实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNADNA工艺学工艺学或或重组DNA技术技术(recombination DNA technique)(recombination DNA technique)，基因操作，基因操作(gene manipulation)(gene manipulation)、遗传工程、遗传工程(genedc engineering)(genedc engineering)。(二二)目的基因目的基因 进行DNA重组的目的主要有两方面： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或使我们感兴趣的基因或DNA序列序列就是目的基因(target DNA)。目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的与mRNA互补的DNA。基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。(三三)载体载体一.表达载体(expression vector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。二.克隆载体(Cloning vector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。第二节第二节 重组重组DNA技术操作的基本过程技术操作的基本过程 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第二节第二节 重要的工具酶重要的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段反转录酶反转录酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶功功 能能识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾一一.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类： 型限制性核酸内切酶的作用特点型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构回文结构(palindrome) 大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样的词语切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶：同功异源酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3 CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3 GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶二、二、DNA连接酶连接酶(基因工程的基因工程的“缝纫针缝纫针”) ： 1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 三、三、DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二种酶活性（去除5 3外切酶活性）。2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。反转录酶(RDDP):多功能酶，无3 5DNA外切酶活性，具有3 5RNA外切酶活性。第四节第四节 常用载体常用载体 定义定义载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件:具有自主复制能力具有自主复制能力有多个单一限制性内切酶的酶切位点（有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS）具有选择性遗传标记具有选择性遗传标记分子量小分子量小拷贝数高（拷贝数高（10个个200个个/细胞）细胞）具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。 常用载体常用载体:质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA1.1.质粒质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNADNA，能独立进行复制。能独立进行复制。特点特点: : 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数。主复制；有较高的拷贝数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。常用质粒载体常用质粒载体（一）（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于，便于重组体细胞的筛选。重组体细胞的筛选。（二）（二） pUC系列载体系列载体:由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建而成，长度为噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：，特点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。具有更小的分子量和更高的拷贝数。 “蓝白斑蓝白斑”筛选筛选: pUC载体中的载体中的LacZ 基因可编码基因可编码-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal）N端的端的-肽链，该肽链，该-肽与宿主细胞肽与宿主细胞(如如E.coli JM109）中）中F 因子因子上的上的LacZ M15基因（基因（-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的活性的-半乳糖苷酶，分解生色底物（半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外）形成蓝色菌落。当外源基因插入源基因插入MCS后，后，LacZ -肽基因的读码框被破坏，不能合成完整肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的的-半乳糖苷酶分解底物半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为，菌落呈白色。称为“蓝白斑蓝白斑”筛选。筛选。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19质粒载体图 （三）其它质粒载体1能在体外转录体外转录克隆基因的质粒载体: T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点)2穿梭穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）: 具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核细胞之间往返穿梭.（四）T-A克隆载体多克隆位点两侧的3末端携带有未配对的T碱基。由于许多耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都有在PCR产物3末端加上A碱基的特性，因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中。获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制。二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒。（一）噬菌体载体1噬菌体的特点 线状双链DNA，全长48 502bp，由左右两臂组成，两端为12碱基组成的彼此完全互补的5单链突出黏性末端，称为cos位点。感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；感染效率远高于质粒载体。 2噬菌体载体的构建优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；噬菌体的感染效率高噬菌体作为载体用于分子克隆的示意图DNA重组体外包装携带外源DNA有感染性的病毒颗粒感染大肠杆菌（二）粘粒载体结构与特点：1含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 2含有抗药性标记（如Ampr基因）和自主复制成分 3具有限制性内切酶位点 4粘粒分子小粘粒分子小 如pJB8为5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可达45kb）5某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记，便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。（三）M13噬菌体载体M13是一种丝状单链噬菌体，6 407bp，为闭环单链闭环单链DNA。M13只能感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌，在细菌内复制时形成双链DNA，这种复制型（replication form，RF）M13相当于质粒，可用作基因克隆载体。三、人工染色体载体三、人工染色体载体酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体,主要包括以下调控元件：着丝粒（centromere，CEN），以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；端粒（telomere，TEL），作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短；复制起始点和限制性酶切位点；选择标记；原核序列及调控元件：复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。EcoR和BamH双酶切EcoR酶切连接YAC结构图及基因克隆过程 四、病毒载体四、病毒载体质粒载体、噬菌体载体主要以原核细胞作为宿主细胞。为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展了用动物病毒改造的病毒载体等。有两类：整合型和游离型。（一）反转录病毒载体单正链RNA病毒特点：具有广泛的哺乳动物细胞宿主；可主动感染分裂细胞,反转录生成双链DNA，可整合到宿主染色体中，持续表达外源基因局限性：只能感染并整合到增殖分裂期的细胞；装载容量比较小，仅达8kb；有诱变危险 （二）腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒优点：可插入大片段外源基因，可达35kb；宿主范围广，尤其人类是其自然宿主；可感染分裂期和非分裂期细胞；不整合，瞬时表达，因而安全性好。不足：病毒基因组较大，构建载体较复杂；几乎可感染所有细胞，缺乏特异性；载体不发生整合，只能短暂表达。第五节第五节 目的基因的获取和体外重组目的基因的获取和体外重组1. 化学合成法：化学合成法：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2. 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library):3. cDNA文库文库(cDNA library):4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)一一.目的基因的获取目的基因的获取:1.1.化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.从基因组从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因基因组基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生物体整指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有套遗传信息的所有DNA序列序列限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3. 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T TcDNA:指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA (mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单互补的单链链DNA。以单链。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNA二二. .外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接: :体外重组体外重组方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接1. 粘性末端连接粘性末端连接DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体2. 平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase) 的的作作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子 由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 4. 人工接头人工接头(linker)连接连接利用人工合成的接头连接重组DNA分子（五）T-A克隆 T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。一、重组一、重组DNADNA分子的导入分子的导入选定的受体细胞应具备的条件：1. 易于接纳重组DNA分子导入；2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制；3.不存在特异性降解外源DNA的酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征。常用的导入方法常用的导入方法: : （一）转化（transformation）（二）转染（transfection）（三）感染（infection）第六节第六节 重组重组DNA分子的导入和筛选与鉴定分子的导入和筛选与鉴定1.氯化钙法：氯化钙法：细菌处于低温、细菌处于低温、低渗低渗CaCl2溶液中，菌细胞溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组球形，经短暂热休克后重组DNA易进入易进入2.电穿孔法：电穿孔法：除特殊仪器外除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。浓度等参数。50-100mmol/LCaCl2 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程 方法：方法： 磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿电穿孔孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。 脂质体转染脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。 显微注射显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1根据载体的抗药性标记筛选 2根据载体的抗药性标记插入失活选择3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 4根据插入的外源基因性状进行筛选 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法二二.重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1.抗药性标记选择抗药性标记选择AmprTetrBamH位点BamH酶切BamH酶切DNA连接酶目的DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板 2.抗药性标记插入失活选择3根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选 :AmN2H 互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法:（四）PCR法 某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增，不但可快速扩增插入的目的片段，而且可以直接进行DNA序列分析。 如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出ACTGAAGGCT表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化第七节第七节 克隆基因的表达克隆基因的表达 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件：1启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。2增强子 3剪接信号4终止信号和PolyA化信号5遗传选择标记 胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆 疾病基因发现的典型例子疾病基因发现的典型例子: 脆性脆性X综合征综合征:脆性脆性 X 染色体是指在染色体是指在 Xq27 Xq28 带之间的染色体呈带之间的染色体呈细丝样，由于这一细丝样部位易发生断裂。故称脆性部位细丝样，由于这一细丝样部位易发生断裂。故称脆性部位（ fragile site ）。）。其典型的特征为中度到重度的智力障碍，巨睾丸大耳朵、语言障碍、智力低下，智商（ IQ ）为 0 50 。由于女性有两条 X 染色体，多为携带者，其中 2/3 智力正常， 1/3 有轻度智力低下。 分子遗传学诊断:已基本取代染色体分析,主要检测FMR1 基因CGG重复扩展及甲基化状况。目前有两种方法:多聚酶链反应(PCR) 和Southern 印迹二、生物制药二、生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有5050多种基因工程药物上市，近千种处于研发多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。了不可估量的社会效益和经济效益。 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂血液因子血液因子VIII颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子促红细胞生成素促红细胞生成素生长因子生长因子(bFGF, EGF)生长素生长素胰岛素胰岛素干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )白细胞介素白细胞介素超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶单克隆抗体单克隆抗体乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗功功 能能抗凝抗凝促进凝血促进凝血剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化治疗侏儒症治疗侏儒症治疗糖尿病治疗糖尿病抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞抗组织损伤抗组织损伤利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗预防乙肝预防乙肝预防霍乱预防霍乱