分子生物学实验步骤总结超全

一 目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（1） 仪器1） 台式高速离心机2） 恒温水浴箱3） 枪式移液器4） 灭菌的EP管和Tip头（2） 试剂1） 溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase2)溶液：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K3） 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4） 氯仿：异戊醇（24：1）5） 3mol/L NaAc(pH5.2)6） 异丙醇或无水乙醇7） 70%乙醇8) TE缓冲液： 10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0(3) 实验步骤1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2） 将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37C水浴保温过夜。3） 加250uL溶液，55C水浴保温4小时。4） 加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。5） 向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。6） 向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。7） 14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。8） 将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20C保存。9） 进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6）氯仿异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9) 1molLHCl。10) 0.2mol/LNaOH。11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml 乙醛液浓乙醛：H2O1：50（VV）。12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13) 0.05mol/LNaOH。14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。（二）实验步骤：1) 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2) 将匀浆无损转入25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3) 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4) 将试管置72水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1（VV），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5) 再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6) 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7) 然后加入0.5ml 左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。8) 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9) 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5070g/ml，并在37水浴中保温30min，以除去RNA。10) 加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11) 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。2、 PCR扩增目的基因(1) 器材1) 微量移液器2) 灭菌的Tip头、PCR管3) PCR扩增仪4) 目的DNA（DNA模板）5) dNTP混合物6) 引物对7) Tap酶8) PCR扩增试剂盒（二）试剂1）10PCR 缓冲液（含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, pH8.3，0.1%明胶） 2) 脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。） 3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。 4) 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 5) 3M NaAc 、ddH2O6) 无水乙醇：70%乙醇 7) TE缓冲液 （三）实验步骤1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀） ddH2O: 补至终体积（25l） 10PCR缓冲液 1/10总体积 2.0mM dNTPs 1l 2U/l Taq DNA聚合酶 0.5l 引物混合液（10 pmol /l /引物） 1l DNA模板 0.6l 混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。 2）在设定好的PCR仪上反应 95C，5min；95C，1min；56C，1min；72C，2min。反应30轮。 3）反应结束后，将反应管在72C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4C。 取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4）6）。 4）转至1.5ml离心管，向管中加25l酚，25l氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。 5）吸取上层液，转至另一已加5l 3M NaAc的1.5ml的离心管，加150l无水乙醇，-20C过夜。 6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干（60C），溶于20l TE。 （四）技术要点 1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。 (1) 引物浓度：10 pmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。 (2) 引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33g。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2g/l，再取部分稀释至10 pmol /l。 引物浓度计算公式：1pmol=(3.310-4g) n ，n是引物的碱基数 (3) Mg2+：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团， Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。 (4) 模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA 20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。 (5) Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100l。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3端加A。 2）扩增轮数与退火温度扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：Tm值=（GC4+AT2）4 3、 琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及材料 目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂 盒 1)TAE电泳缓冲液浓储存液 50：242g Tris；57.1ml冰乙酸；100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。使用液 1：4.84g Tris；1.15ml冰乙酸；2ml 0.5 mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。 2）样本液10缓冲液: 60%蔗糖；0.4%溴酚蓝（三）实验步骤1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取0.6g琼脂糖加80ml TAE（1），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55C-65C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。 3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。 4）DNA样品按照10：1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。 5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。 6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。（四 ）技术要点 1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。 表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%） 分离DNA的有效范围（kb） 0.3 605 0.6 201 0.8 100.8 1.0 70.5 1.2 60.4 1.5 30.2 2.0 20.1 2）电泳中注意防止凝胶发热。 3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂 糖凝胶的有效分离范围缩小。 4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。 四、目的DNA的回收纯化(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统2）凝胶成像仪3）离心机4）单面刀片5）恒温水浴锅(二）试剂1） DNA回收试剂盒2）50TAE3） ddH2O(三)实验步骤1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖放入1.5ml离心管中。2） 按每100mg琼脂糖加入300600l 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体再将吸附柱放入同一个收集管中。4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6） 12000rpm 室温空离心1分钟。7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20。五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组(一)仪器及材料1）回收得到的目的DNA2）BamHI、 HindIII、 T4 DNA连接酶、 DNA回收试剂盒3）pUC18CAT 质粒、双蒸水、10酶切通用缓冲液K4）EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机 表1 常用酶切缓冲液配方 缓冲液名称 配 方 贮存温度（） 10L 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT -20 10M 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 500mM NaCl -20 10H 500mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 1000mM NaCl -20 10K 200 mM Tris-HCl,pH8.5100 mM MgCl210 mM DTT 1000mM KCl -20 10T（BSAFree）330mM Tris-Ac,pH7.9 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc -20 0.1% BSA -20 0.1% Trition X-100 -20 (二）实验步骤1）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系：酶切反应体系（20ul体系）管号 核酸 10酶切通用缓冲液K ddH2O BamHI HindIII 1 15ul目的DNA 2ul 0ul 2ul 1ul 2 10ulpUC18CAT质粒 2ul 5ul 2ul 1ul2)37保温三小时。3) 酶切产物的纯化回收，每100ul溶液加入700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四4) 载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）：目的DNA pUC18CAT质粒 10连接缓冲液 T4 DNA连接酶 ddH2O X ul Y ul 2ul 1ul Zul目的DNA和pUC18CAT质粒的相对浓度约为1:31:105）14水浴保温过夜。6、 大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化 (1) 仪器1 小型高速离心机2 恒温摇床3 恒温培养箱4 20冰箱5 恒温水浴器 6 超净工作台7 高压灭菌锅(二)材料1氨苄青霉素2大肠杆菌DH5a3连接产物4离心管5 枪头、微量移液器6试管、培养皿、三角瓶(三)试剂LB 培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。 氨苄青霉素： 用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存。 卡那霉素： 用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37培养24小时，保存在室温。 含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50左右，加入终浓度为100g/ml 的氨苄青霉素或50g/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37培养24小时，保存在室温。 0.1 M CaCl2（根据需要确定配制的量）：11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22m滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。 50甘油： 50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。 其他： DH5大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500 mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。（四）实验步骤 1）以接菌环从70保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2）挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37振荡培养过夜； 3）按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中，37剧烈振荡培养1.5-2 小时左右，至OD600达0.4-0.6； 4）将菌液冰浴10 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4，4000 rpm离心10 分钟； 5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的0.1 M CaCl2中，冰浴20 分钟，4，4000 rpm离心10 分钟； 6）弃尽上清。以12.5 mL（菌液体积的5）预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50L在冰上分装，80保存； 注：以上操作全部在无菌条件下进行。 7）取连接产物2l（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上； 8）从80冰箱取3管感受态细菌（每管50l），在冰上融化； 9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上2030分钟；同时做两个对照管 受体菌对照：50l感受态细胞+2l无菌水 质粒对照：50l0.1 M CaCl2溶液+2l连接产物10）42加热90秒，迅速置于冰上12分钟； 11）每管加入4001000l的无抗生素液体LB培养基，在37摇床缓慢摇荡2060分钟； 12）用10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50l并用移液器吹吸重悬细菌； 13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB琼脂糖平板上，倒置于37培养箱培养12小时以上，出现菌落。（五）技术要点1加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5； 242热激时，必须要保证温度的准确性； 3涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度合适的单菌落； 4涂布平板之后，在37培养的时间不超过1216小时，否则可能产生卫星菌落； 5防止其它质粒污染； 6防止其它细菌污染。 7、 质粒DNA的提取及重组子的鉴定(1) 仪器1 恒温培养箱2 恒温摇床3 小型高速离心机4 高压灭菌锅 5 分光光度计（2） 试剂及材料1.转化重组子 2.缓冲液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，pH8.0。3.碱溶液：0.2M NaOH; 1%SDS, PH12.5。 4.乙酸缓冲液：3M NaAC；2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。 5.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。 6.RNA酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20C保存。 7.LB培养基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH调pH至7.5，高压灭菌。 8.氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存。 9.LA培养基: 在LB培养基中加入终浓度100g/ml的氨苄青霉素。 10.异丙醇 11.酚-氯仿-异戊醇：25：24：1 12.70%乙醇 13.3M NaAc （3） 实验步骤1） 从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37震荡培养，待细菌浓度增至OD600=11.2时，收获细菌。菌液转到1.5mlEppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。 2）加100l缓冲液A，充分混悬细菌。 3）加200l碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。 4）加150l乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。 5）离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。 6）加等体积的酚-l氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，离心10000rpm，1分钟。 7）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。 8）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20C，10分钟。 9）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加入1ml 70%乙醇。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复加入1ml 70%乙醇一次，弃上清，干燥箱中干燥。 10）干燥后，加入30l TE（含RNA酶A 10ul，20g/ml），使质粒溶解，-20C保存备用。11) 取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂 10限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为20.0ul。12） 将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37C水浴保温34小时。酶切结束时，加入0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使终浓度达10mmol/L，以终止反应。13） 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。（四）技术要点1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。 2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。 3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。