资源描述
一 目的基因的获得细菌基因组DNA的提取(1) 仪器1) 台式高速离心机2) 恒温水浴箱3) 枪式移液器4) 灭菌的EP管和Tip头(2) 试剂1) 溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl,pH8.0 50mmol/L EDTA,pH8.0 500ug/ml 溶菌酶(现用现配) 100ug/ml RNase2)溶液:100mmol/L Tris-Hcl,pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K3) 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)4) 氯仿:异戊醇(24:1)5) 3mol/L NaAc(pH5.2)6) 异丙醇或无水乙醇7) 70%乙醇8) TE缓冲液: 10mmol/L Tris-Hcl,pH8.0 1mmol/L EDTA,pH8.0(3) 实验步骤1) 5mL细菌过夜培养,5000rpm离心10分钟,去上清液。2) 将菌体细胞悬于250uL溶液1中,37C水浴保温过夜。3) 加250uL溶液,55C水浴保温4小时。4) 加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻混匀,于14000rpm离心10分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤4一次。5) 向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻混匀,于14000rpm离心10分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤5一次。6) 向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇(或2.5倍体积的无水乙醇),冰上放置30分钟。7) 14000rpm离心20分钟,弃上清,用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次,弃上清,沉淀于室温干燥。8) 将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中,-20C保存。9) 进行DNA含量和纯度检测,琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法:(一)试验试剂:1)研磨缓冲液:称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTANa分别溶解后合并为一,用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0,并定容至1000ml。2)10 SSC溶液:称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。3)1 SSC溶液:用10 SSC溶液稀释10倍。4)0.1 SSC溶液:用1 SSC溶液稀释10倍。5)Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前经80水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。6)氯仿异戊醇:按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。7)5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4H2O 70.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8) SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在7080的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。9) 1molLHCl。10) 0.2mol/LNaOH。11) 二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中,添加1.5ml 浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml 乙醛液浓乙醛:H2O1:50(VV)。12) 1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。13) 0.05mol/LNaOH。14) DNA标准液:取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100g/ml 的标准溶液。(二)实验步骤:1) 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中,加10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。2) 将匀浆无损转入25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3) 离心形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4) 将试管置72水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液提取液:高氯酸钠溶液4:1(VV),使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5) 再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min,取上清液置小烧杯中。6) 用滴管吸95的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7) 然后加入0.5ml 左右的10 SSC,使最终浓度为1 SSC。8) 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9) 加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为5070g/ml,并在37水浴中保温30min,以除去RNA。10) 加入等体积的氯仿异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。11) 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。2、 PCR扩增目的基因(1) 器材1) 微量移液器2) 灭菌的Tip头、PCR管3) PCR扩增仪4) 目的DNA(DNA模板)5) dNTP混合物6) 引物对7) Tap酶8) PCR扩增试剂盒(二)试剂1)10PCR 缓冲液(含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, pH8.3,0.1%明胶) 2) 脱氧核苷三磷酸dNTPs:配成 10mM dATP,dTTP,dGTP,dCTP各10mM,用NaOH溶液调节至pH8.3。) 3)氯仿-异戊醇:配成24:1的比例,室温避光保存。 4) 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 5) 3M NaAc 、ddH2O6) 无水乙醇:70%乙醇 7) TE缓冲液 (三)实验步骤1)在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份:(混匀) ddH2O: 补至终体积(25l) 10PCR缓冲液 1/10总体积 2.0mM dNTPs 1l 2U/l Taq DNA聚合酶 0.5l 引物混合液(10 pmol /l /引物) 1l DNA模板 0.6l 混匀后,在台式离心机上瞬时离心10秒。 2)在设定好的PCR仪上反应 95C,5min;95C,1min;56C,1min;72C,2min。反应30轮。 3)反应结束后,将反应管在72C充分延伸10分钟,再将反应管冷却至4C。 取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三),确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物,可以通过纯化得到改善。纯化继续4)6)。 4)转至1.5ml离心管,向管中加25l酚,25l氯仿-异戊醇混匀,离心10000rpm,30秒。 5)吸取上层液,转至另一已加5l 3M NaAc的1.5ml的离心管,加150l无水乙醇,-20C过夜。 6)离心10000rpm,10分钟,弃上清,加0.5ml 70%乙醇,10000rpm离心,5分钟。弃上清,烤箱中干(60C),溶于20l TE。 (四)技术要点 1)PCR各组份的配制与加样量要特别注意。 (1) 引物浓度:10 pmol 足够30个循环,浓度太高导致与模板非特异结合增强,扩增非 特异片段增多,浓度太低则扩增效率低。 (2) 引物的配制:厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值,1 OD约含33g。开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度2g/l,再取部分稀释至10 pmol /l。 引物浓度计算公式:1pmol=(3.310-4g) n ,n是引物的碱基数 (3) Mg2+:使用浓度一般在1.5mM,要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团, Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。 (4) 模板DNA:浓度不可过高,质粒DNA 20ng即可,若需第二次扩增,可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。 (5) Taq DNA聚合酶:一般用量5U/100l。酶量过大易导致扩增非特异序列,Taq酶具有末端转移酶活性,常在3端加A。 2)扩增轮数与退火温度扩增轮数:一般30轮以内就可使模板扩增106倍,超过30轮,错配率升高。 退火温度计算公式:Tm值=(GC4+AT2)4 3、 琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1)琼脂糖凝胶电泳系统(天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪)2)凝胶成像仪(二)试剂及材料 目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂 盒 1)TAE电泳缓冲液浓储存液 50:242g Tris;57.1ml冰乙酸;100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。使用液 1:4.84g Tris;1.15ml冰乙酸;2ml 0.5 mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。 2)样本液10缓冲液: 60%蔗糖;0.4%溴酚蓝(三)实验步骤1)将有机玻璃内槽洗净、晾干,放置于水平制胶器中,插好梳子,在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2)0.8%琼脂凝胶板的配制:取0.6g琼脂糖加80ml TAE(1),20ml水,微波炉加热融化3分钟,将其冷却至55C-65C,加入EB储存液1ul,小心混匀,缓慢倒入制胶槽中。(根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度)。 3)充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入TAE(1),使其液面略高于琼脂糖板,拨出样品梳。 4)DNA样品按照10:1的比例加入样本液,在腊面纸上混匀,用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔,在同一凝胶板上进行电泳。 5)接通电泳槽与电泳仪的电源,维持稳压1-5V/cm(按照两极之间距离计算),电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断,当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。 6)剥胶并在凝胶成像仪观察结果。(四 )技术要点 1)选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶,大片段则用低浓度凝胶,在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。 表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度(%) 分离DNA的有效范围(kb) 0.3 605 0.6 201 0.8 100.8 1.0 70.5 1.2 60.4 1.5 30.2 2.0 20.1 2)电泳中注意防止凝胶发热。 3)将电泳仪置稳压档,电压设置小于5V/cm(电极间的最小路径)。随着电压的增加,琼脂 糖凝胶的有效分离范围缩小。 4)溴化乙锭有强烈的致癌作用,操作时注意防护。 四、目的DNA的回收纯化(一)仪器1)琼脂糖凝胶电泳系统2)凝胶成像仪3)离心机4)单面刀片5)恒温水浴锅(二)试剂1) DNA回收试剂盒2)50TAE3) ddH2O(三)实验步骤1)在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块,尽可能除去多余的琼脂糖放入1.5ml离心管中。2) 按每100mg琼脂糖加入300600l 溶胶液的比例加入溶胶液(本实验加500ul),置55水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化,期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱,12000rpm 室温离心1分钟,倒掉收集管中的液体再将吸附柱放入同一个收集管中。4)在吸附杜中加入500uI漂洗液,室温静置1分钟后, 12000rpm 室温离心30秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。5)再在吸附柱中加入500uI漂洗液, 12000rpm 室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。6) 12000rpm 室温空离心1分钟。7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中,在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液,室温静置2分钟后, 12000rpm 室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次),将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20。五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组(一)仪器及材料1)回收得到的目的DNA2)BamHI、 HindIII、 T4 DNA连接酶、 DNA回收试剂盒3)pUC18CAT 质粒、双蒸水、10酶切通用缓冲液K4)EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机 表1 常用酶切缓冲液配方 缓冲液名称 配 方 贮存温度() 10L 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT -20 10M 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 500mM NaCl -20 10H 500mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 1000mM NaCl -20 10K 200 mM Tris-HCl,pH8.5100 mM MgCl210 mM DTT 1000mM KCl -20 10T(BSAFree)330mM Tris-Ac,pH7.9 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc -20 0.1% BSA -20 0.1% Trition X-100 -20 (二)实验步骤1)在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系:酶切反应体系(20ul体系)管号 核酸 10酶切通用缓冲液K ddH2O BamHI HindIII 1 15ul目的DNA 2ul 0ul 2ul 1ul 2 10ulpUC18CAT质粒 2ul 5ul 2ul 1ul2)37保温三小时。3) 酶切产物的纯化回收,每100ul溶液加入700ul溶胶液,其余的操作步骤详见实验四4) 载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系(20ul):目的DNA pUC18CAT质粒 10连接缓冲液 T4 DNA连接酶 ddH2O X ul Y ul 2ul 1ul Zul目的DNA和pUC18CAT质粒的相对浓度约为1:31:105)14水浴保温过夜。6、 大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化 (1) 仪器1 小型高速离心机2 恒温摇床3 恒温培养箱4 20冰箱5 恒温水浴器 6 超净工作台7 高压灭菌锅(二)材料1氨苄青霉素2大肠杆菌DH5a3连接产物4离心管5 枪头、微量移液器6试管、培养皿、三角瓶(三)试剂LB 培养基(根据需要确定配制的量): 10g/L 胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L NaCl,加水至1000ml,高压灭菌,保存在室温。 氨苄青霉素: 用去离子水配成100mg/ml的储存液,过滤除菌,20分装保存。 卡那霉素: 用去离子水配成100mg/ml的储存液,过滤除菌,20分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量): 10g/l 胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l NaCl,15g/l 琼脂粉,加水至1000ml,高压灭菌;铺平板,冷却后在37培养24小时,保存在室温。 含有抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量): 10g/l 胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l NaCl,15g/l 琼脂粉,加水至1000ml,高压灭菌;当培养基降温至50左右,加入终浓度为100g/ml 的氨苄青霉素或50g/ml卡那霉素,并铺平板,冷却后在37培养24小时,保存在室温。 0.1 M CaCl2(根据需要确定配制的量):11.099克溶解在1000ml灭菌水中,0.22m滤器过滤除菌。氯化钙分子量为:110.99。 50甘油: 50ml甘油加入50ml水,混匀,高压灭菌。 其他: DH5大肠杆菌,灭菌玻璃平皿若干,接菌环,加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个,灭菌50ml和500 mL离心管若干,灭菌刻度吸管若干,冰盒,移液器,灭菌移液器吸头,灭菌Eppendorf管等。(四)实验步骤 1)以接菌环从70保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板,培养12小时; 2)挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中,37振荡培养过夜; 3)按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中,37剧烈振荡培养1.5-2 小时左右,至OD600达0.4-0.6; 4)将菌液冰浴10 分钟,转移至预冷的500 mL离心管中,4,4000 rpm离心10 分钟; 5)弃上清,将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的0.1 M CaCl2中,冰浴20 分钟,4,4000 rpm离心10 分钟; 6)弃尽上清。以12.5 mL(菌液体积的5)预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀,同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液,混匀后按每支50L在冰上分装,80保存; 注:以上操作全部在无菌条件下进行。 7)取连接产物2l(在实际操作中,经常需要取全部连接产物)置于冰上; 8)从80冰箱取3管感受态细菌(每管50l),在冰上融化; 9)将连接产物加入感受态细菌中,混匀,放置冰上2030分钟;同时做两个对照管 受体菌对照:50l感受态细胞+2l无菌水 质粒对照:50l0.1 M CaCl2溶液+2l连接产物10)42加热90秒,迅速置于冰上12分钟; 11)每管加入4001000l的无抗生素液体LB培养基,在37摇床缓慢摇荡2060分钟; 12)用10000rpm离心10秒,弃去大部分上清,留下约50l并用移液器吹吸重悬细菌; 13)取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性(根据质粒所携带抗生素抗性基因而定)的LB琼脂糖平板上,倒置于37培养箱培养12小时以上,出现菌落。(五)技术要点1加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5; 242热激时,必须要保证温度的准确性; 3涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高,而且所用感受态细菌的效率也很高,则吸取较少量的菌液;反之,可以增加,甚至全部菌液涂布平板。判断的标准:在LB平板上生长密度合适的单菌落; 4涂布平板之后,在37培养的时间不超过1216小时,否则可能产生卫星菌落; 5防止其它质粒污染; 6防止其它细菌污染。 7、 质粒DNA的提取及重组子的鉴定(1) 仪器1 恒温培养箱2 恒温摇床3 小型高速离心机4 高压灭菌锅 5 分光光度计(2) 试剂及材料1.转化重组子 2.缓冲液A:50mM葡萄糖;10mM EDTA;25mM Tris-HCl,pH8.0。3.碱溶液:0.2M NaOH; 1%SDS, PH12.5。 4.乙酸缓冲液:3M NaAC;2M乙酸,pH4.8(盐酸调pH)。 5.TE缓冲液:10mM Tris-HCl,pH8.0;1mM EDTA.。 6.RNA酶A溶液:10mg/ml RNA酶 A,用TE配制,100C煮10分钟,灭活DNA酶。缓慢冷却至室温,10000r/min离心5min,上清于-20C保存。 7.LB培养基: 10g胰蛋白胨,5g酵母粉,5g NaCl加水至1000ml,用1M NaOH调pH至7.5,高压灭菌。 8.氨苄青霉素:用去离子水配成100mg/ml的储存液,过滤除菌,20分装保存。 9.LA培养基: 在LB培养基中加入终浓度100g/ml的氨苄青霉素。 10.异丙醇 11.酚-氯仿-异戊醇:25:24:1 12.70%乙醇 13.3M NaAc (3) 实验步骤1) 从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中,37震荡培养,待细菌浓度增至OD600=11.2时,收获细菌。菌液转到1.5mlEppendorf管中,离心8000rpm,2分钟,弃上清。 2)加100l缓冲液A,充分混悬细菌。 3)加200l碱溶液,裂解细菌,反复倒转管5次至溶液清亮,开盖后能拉出丝状粘稠液体。 4)加150l乙酸缓冲液,反复倒转管5次,混匀,冰浴10分钟。 5)离心10000rpm,5分钟,将上清转移至另一Eppendorf管中。 6)加等体积的酚-l氯仿-异戊醇(25:24:1)混匀,离心10000rpm,1分钟。 7)吸上层水相至另一Eppendorf管中,加等体积的氯仿混匀,离心10000rpm,1分钟。 8)吸上层水相至另一Eppendorf管中,加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温或-20C,10分钟。 9)离心10000rpm,10分钟,弃上清,加入1ml 70%乙醇。勿混匀,离心10000rpm,5分钟,重复加入1ml 70%乙醇一次,弃上清,干燥箱中干燥。 10)干燥后,加入30l TE(含RNA酶A 10ul,20g/ml),使质粒溶解,-20C保存备用。11) 取一个灭菌的EP管,依次加入下列试剂 10限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为20.0ul。12) 将上述试剂轻轻混匀,稍加离心,集中溶液,37C水浴保温34小时。酶切结束时,加入0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使终浓度达10mmol/L,以终止反应。13) 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。(四)技术要点1)每一步都要充分混匀,为获得高产量DNA,第一步需使菌体完全重悬。 2)加入碱溶液后,反复混匀使细菌充分裂解,但需要轻柔,一旦裂解(液体变清亮)必须马上加乙酸缓冲液中和。 3)70%乙醇洗涤时,离心后应小心地将上清倒掉,注意这时DNA沉淀较疏松,易从管壁上脱落。
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