蛋白质偶联技术

蛋白质交联技术蛋白质交联是指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）一共价键的方式连接于蛋白质分子四大行，以制备人工抗原酶标抗体等。但标志交联方法首先发展于人孔抗原的制备研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质如化学药物，神经递质等与蛋白质或多糖等载体大分子物质共价结合，使其具有抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。目前经常采用的的偶联方法主要有重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法，碳化二亚胺法等。现将我对上述方法的理解研究归结如下:重氮法（1）（2）芳香族伯胺在低温（05）和强酸（盐酸或硫酸）溶液中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐的反应称为重氮化反应。若环上具有-N02或-SO3H等的芳胺可以高一些（4060）温度进行重氮化反应。 在芳香重氮正离子中， 键呈线形结构， 键中的一个 轨道与苯环上的 轨道形成共轭体系，电子离域，使重氮盐在低温、强酸介质中能稳定存在。 苯环上有吸电子基团的重氮盐较为稳定，这是由于强化了 与苯环的共轭，重氮盐在弱酸、中性或碱溶液中与芳胺或酚类作用，由偶氮基(N=N)将两个分子偶联起来，生成偶氮化合物的反应，称为偶联反应。可合成偶氮染料。 偶联反应是亲电取代反应，重氮阳离子是弱的亲电试剂，它进攻苯环上电子出现几率密度比较大的碳原子。 重氮盐与酚在微碱性溶液中很快发生偶联反应。 这是由于： 带负电的氧原子比中性的羟基更能使苯环活化。 但溶液PH10: 所以在进行偶联反应时，可考虑到多种因素，既考虑到 的活性，又要考虑到 和酚的活性，选择最适宜的反应条件，才能收到预期的效果。戊二醛法戊二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下： 反应机制脂肪族醛、酮与氨、伯胺的反应可生成亚胺，也称为西佛碱（Schiff base)：脂肪族醛、酮生成的亚胺中含的C=N双键在反应条件下不是很稳定的，它易于发生进一步的聚合反应。芳香族的醛、酮与伯胺反应生成的亚胺则比较稳定。 西佛碱是一类有机弱碱，其氮上的孤对电子的活性比较低。在有机合成中亚胺类化合物多有应用。戊二醛是反应条件最温和的偶联剂之一，可以在440，pH6.89之间反应，反应时间控制在25h。一般条件下温度在室温下反应即可，但是如果反应物活性较高，可以在4条件下反应。在磷酸缓冲液中pH6.87.5，在碳酸缓冲液中pH8-9.一般来说，pH越高，西弗碱的生成率越高，而且稳定，但是也越容易反应自身的偶联反应。pH越低，西弗碱的生成率越低，而且稳定不高。反应体系中，戊二醛的含量一般在0.2-1%之间。偶联后的物质均一性不好，稳定性差，一般用于酶标产品。可以用硼氢化钠等还原剂将C=N还原成C-N，稳定性增强，一般硼氢化钠的加入量是10mg/ml，加入后有大量的气泡产生。碳化二亚胺法碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。 此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。 两个截图碳化二亚胺主要有两种，一种是水溶性（主要是EDC），一种是非水溶性（主要是DCC）。先是羧基上的氧原子作为亲核进攻试剂进攻N=C=N中的碳原子，形成活性中间结构。氨基跟令一个双键发生亲核反应，将EDC推掉，形成酰胺结构。通常文献中EDC的反应pH是4.76之间，但是碳化二亚胺最佳活性是pH7.5左右。羟基琥珀酰亚胺（NHS）通常会作为该反应的催化剂，即EDC/NHS联用,可以大幅度的提高反应的速率。DCC有一定的水溶性，但是通常反应体系是80%的DMF反应。DCC的存在会对后续反应有影响，通常可以通过水洗的方法除去。戊二酸酐法小分子物质没有氨基或羧基不能直接跟蛋白偶联，通常需要通过化学衍生的方法衍生出氨基或是羧基。抗生素等小分子中有很多是含有羟基的，一般采用戊二酸酐法进行衍生。反应机制反应多数情况下可由酸(质子酸及Lewis酸)催化，其机理为加成-消除。其过程为醇或酚的氧亲核进攻酰化剂的羰基碳(可能已由酸催化作用更加极化，甚至已形成碳正离子)，由此加成到羰基上，然后消除酰化剂上的离去基团(该离去基团可能需要预先质子化)，得到酯。 主要影响因素为底物的结构、酰化剂及催化剂等。与酸和酯作酰化剂相比，酸酐的酰化活性较强，而且酰化反应是不可逆的。酰化反应过程可以被酸(硫酸等质子酸以及三氟化硼等Lewis酸)和碱(主要为醋酸钠以及三乙胺等有机碱)所催化。酰化对象可以是醇，也可以是酚。其酸催化的反应机理可以是酰基正离子历程，也可以是加成-消除；碱催化的机理为加成-消除。 (1) 底物结构的影响底物为醇或酚，亲核物种为羟基氧原子。当氧原子电子云密度降低时反应活性会降低，由此可知，与烷基醇相比酚及烯丙醇的酰化会困难一些，而难以酰化的底物就需要较强的酰化剂，比如酚的酰酸化一般要用酐或酰卤。此外空间障碍也是一个较大的影响因素，如仲醇的反应速率低于伯醇，而叔醇在酸催化下会形成碳正离子，所以叔醇的酯化一般是单分子亲核取代(SN1)机理。 (2) 酰化剂的影响在一定的反应条件下，羧酸、酸酐、酰卤、酯以及酰胺都可以成为酰化剂，其酰化活性顺序一般为酰卤(BrCl)酸酐酯酸酰胺，这一顺序实际上与离去基团的离去能力一致。3催化剂催化剂可以是质子酸，如浓硫酸、磷酸、干燥氯化氢气体以及高氯酸等，也可以是对甲苯磺酸等有机酸。无机质子酸价廉易得；有机质子酸温和，可避免某些不稳定底物的分解或发生副反应。还可以使用Lewis酸，如三氯化铝以及钛酸酯等，可避免某些不稳定底物的分解或发生副反应。也可以使用强酸性离子交换树脂，以及树脂负载的Lewis酸，如强酸性离子交换树脂负载SnCl2。如肉桂酸甲酯的合成：BF3催化的加成-消除反应(质子酸催化时双键会有反应，甚至会发生芳环上的烷基化反应)。除质子酸、Lewis酸外，有一些化合物可以一定的方式与底物羧酸结合，并使其羰基碳更容易被亲核试剂进攻，从而达到催化目的，如DCC及其类似物。DCC及其类似物催化羧酸和醇的酯化机理。注：1 加入有机碱可以帮助羧酸去质子，增加其亲核能力，故在此反应过程中加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)等可以提高反应速率。2 主要用于原料昂贵或结构复杂、基团敏感难以衍生的场合，如多肽合成。偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)/三苯基膦也以类似的机理起到催化作用。由以上机理可知，三苯基膦的三个苯基在醇与三苯基膦结合时会成为障碍，所以，该反应对伯醇和仲醇具有选择性，而叔醇难以反应。与酸和酯作酰化剂相比，酸酐的酰化活性较强，而且酰化反应是不可逆的。酰化反应过程可以被酸(硫酸等质子酸以及三氟化硼等Lewis酸)和碱(主要为醋酸钠以及三乙胺等有机碱)所催化。酰化对象可以是醇，也可以是酚。其酸催化的反应机理可以是酰基正离子历程，也可以是加成-消除；碱催化的机理为加成-消除。酸催化的两种可能的反应机理：碱催化的反应机理也有两种可能性，以DMAP作催化剂为例：酸酐主要用于用酸或酯难以酰化的场合，比如位阻较大的醇和酚的酰化。当醇、酚羟基共存时，三氟化硼可对醇羟基选择性催化酰化。注：这个结果可以在一定程度上支持碱催化时活化羟基的机理。实际上，究竟是活化酸还是活化醇(酚)羟基可能与催化剂的碱性、亲核性以及羟基的酸性和反应条件有关。但长链脂肪酸的酸酐难于制备，所以混酸酐的方法就显得有较大实际意义。混酸酐法一般是把酸酸衍生为相应的三氟乙酸酐、磺酸酐、磷酸酐以及多取代的苯甲酸酐等，实际上也是引入了更好的离去基团。这些酸酐可由羧酸(盐)与相应的酰卤合成。磷酸酐反应示例：该类反应主要包括醇羟基酚羟基跟戊二酸酐发生酰化反应。2连接方法 半抗原与载体的连接通常可用物理和化学方法进行。物理吸附的载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，它们借电荷和微孔吸附半抗原。化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上，这些载体包括血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接。其他不带有氨基或羧基的半抗原，须加以适当的改造，使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，才能与载体连接。 1） 有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原与载体的连接方法 （1）碳化二亚胺法：碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。 此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。 （2）戊二醛法：戍二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下： （3）混和酸酐法：混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主要用以甾体激素与蛋白质的偶连。以烷基氯甲基为偶连剂，最常用的是氯甲基异丁酯。含有羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成混合酸酐，然后在与蛋白质载体上的氨基反应形成肽键。其反应如下： （4）过碘酸氧化法：过碘酸将糖环氧化成双醛基，再与蛋白质上的氨基偶联。本法常用于配糖体类药物与蛋白质的偶联。2） 带有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法进行连接 （1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。其反应式如下： （2） 羧甲基羟胺法：带有酮基的半抗原（如孕酮、睾酮）与O-(羧甲基)羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。其反应式如下： （3） 重氮化的对氨基苯甲酸法：本法适于带有酚基的半抗原（如某些药物）的改造。先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产物再作用于带有酚基的半抗原，从而制得带有羧基的半抗原衍生物。 （4）一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到带有羧基的半抗原衍生物。西弗碱戊二醛本身性质反应pH戊二醛的量反应时间硝基化合物的还原 硝基的还原 工业上用铁粉和水还原硝基苯，但是用大量的铁粉会产生大量含苯胺的铁泥。造成环境的污染。所以，逐渐改用催化加氢的方法，常用的催化剂有镍、铂、钯。 二硝基化合物还原生成二元胺： 硝基的选择性还原 二硝基化合物若只需要还原一个硝基，使用计算的硫化铵、多硫化铵、硫氢化铵或硫化钠的水溶液等选择性还原剂即可达到目的。 如果用氯化亚锡作还原剂，可避免醛的还原： （2）C-N键化合物的还原： 氰还原为胺： 缺点：反应中同时产生少量的第二。第三胺。 特点：还原产物无第二、三胺。 肟还原： 酰胺的还原： 3.还原氨化： 酮和醛与氨（胺）作用，在氢和适当的催化剂存在下，转变为相应的胺。 埃施韦勒-克拉克(Eschweiler-Clarke)反应：在上面反应中，用过量的甲酸代替氢作还原剂，由于第一或第二胺与甲醛作用，则生成氮原子上最少含一个甲基的第三胺，这一反应称为Eshweiler-Clarke反应。 反应过程： 六、烯胺： 结构特点：烯胺类似烯醇，通常是不稳定的，容易转变为互变异构体的亚胺。 从结构上不难看出，烯胺和烯醇负离子类似，可以有两个反应的位置，一个是在碳上，一个是在氮上。 2.反应： 与卤化物（碘甲烷、烯丙基卤、苄卤）反应（主要适用于伯卤代烃）： 烯胺与一般卤代烃反应，易发生N-烃基化反应。这类反应合成意义不大，但当采用强亲电的碘甲烷、烯丙基卤化物、苄卤等。可高产率得到C-烃基化产物（这是由于首先形成N-烃化合物可以发生分子内或分子间转移。形成C-烃化合物） 与亲电烯烃反应（Michael加成反应） 烯胺可以和、-不饱和氰、酯、酮进行烃基化反应。 主要产物是C-烃化产物，原因时反应是可逆的。N-烃化产物可以转变为C-烃化产物。 以上反应的特点： a.反应条件缓和，不需要碱性催化剂。可以避免一般碱性催化剂存在而引起的副反应。 b.很容易控制在一元烷基化阶段。 c.-取代酮生成的烯胺，烃基化时烷基进攻没有取代基的-碳原子。 酰基化反应： 烯胺发生酰化反应最常用的试剂是酰卤，它与烃不同，N-酰化产物，也是良好的C-酰化试剂，因此，可以高产率的形成C-酰化产物。 重氮和偶氮化合物 重氮和偶氮化合物都含有N2原子团。在重氮化合物中N2-的一端和碳原子相连；在偶氮化合物中则两端都和碳相连，其结构中含NN原子团。-N=N-官能团的两端都分别与烃基相连的化合物称为偶氮化合物. 若-N=N-官能团的一端与烃基相连,另一端与其他原子非碳原子(CN例外)或原子团相连的化合物,称为重氮化和物。 脂肪族的重氮化和物多符合 : 一、 芳香族重氮化反应 : 芳香族伯胺在低温（05）和强酸（盐酸或硫酸）溶液中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐的反应称为重氮化反应。若环上具有-N02或-SO3H等的芳胺可以高一些（4060）温度进行重氮化反应。 在芳香重氮正离子中， 键呈线形结构， 键中的一个 轨道与苯环上的 轨道形成共轭体系，电子离域，使重氮盐在低温、强酸介质中能稳定存在。 苯环上有吸电子基团的重氮盐较为稳定，这是由于强化了 与苯环的共轭，二、芳香族重氮盐的性质 重氮基是个正离子，是一个亲电试剂，能进攻活化了的芳环，如酚羟基、氨基的邻、对位： 另一方面它本身又易为亲核试剂所取代，是芳环上导入负性基团，如卤素、羟基、氨基等的可能的途径。所以在合成上非常有用。 重氮盐的反应一般归纳为两类：取代反应和偶联反应。1.取代反应： 重氮基在不同的条件下，可以被羟基（-OH），甲氧基（-OCH3）、卤素（X）、氰基（-CN）、氢原子等取代。 被羟基取代： 被羟基取代时，应注意下列问题：1)该反应在酸性条件下进行，其目的在于防止生成的酚与未反应的重氮盐发生偶合反应。2)该反应使用重氮硫酸氢盐，而不使用重氮盐酸盐，是因为使用重氮盐酸盐除生成酚外，会有副产物氯苯类化合物生成：虽然利用重氮盐来制备酚没很大价值，但是利用这个反应来引进一个羟基于苯环的某一指定位置的碳原子上，在有机合成上很重要。被卤素和氰基取代： 此反应是将碘原子引进苯环的好方法，产量高。 被氢基取代： 被氢原子取代： 许多还原剂如乙醇、次磷酸、甲醛碱溶液等，能发生重氮基被氢原子取代的反应。 这个反应提供了一个从芳环上除去NH2的方法。 了解了上述重氮即被其他原子或基团取代的条件后就可以制备一般不能用直接方法来。还原反应： 3偶联反应： 重氮盐在弱酸、中性或碱溶液中与芳胺或酚类作用，由偶氮基(N=N)将两个分子偶联起来，生成偶氮化合物的反应，称为偶联反应。可合成偶氮染料。 偶联反应是亲电取代反应，重氮阳离子是弱的亲电试剂，它进攻苯环上电子出现几率密度比较大的碳原子。 芳胺 i 三级胺 因中性或弱酸性溶液中，重氮离子的浓度最大，同时过量的胺也不至于生成不活泼的铵盐。 若pH10: 所以在进行偶联反应时，可考虑到多种因素，既考虑到 的活性，又要考虑到 和酚的活性，选择最适宜的反应条件，才能收到预期的效果。