高中生物 第一部分《实验二 微生物的培养和利用》课件7 浙科版选修1

（二）关键技术原理（二）关键技术原理“细菌的划线分离法细菌的划线分离法”赵金秋（西城教研） 摄一、课程标准对于本实验的要求一、课程标准对于本实验的要求实验实验2 2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 脲脲实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 培养基的配制和灭菌操作培养基的配制和灭菌操作 微生物培养的相关知识（微生物培养的相关知识（或布置学生自学或布置学生自学） ：如选择培：如选择培养基、涂布分离法等。设计实验方案。养基、涂布分离法等。设计实验方案。 菌液制备、涂布分离、微生物培养（学生操作）菌液制备、涂布分离、微生物培养（学生操作）（三）整体教学规划的建议（三）整体教学规划的建议三、实验教学具体技术操作问题三、实验教学具体技术操作问题 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂1.设备及用品设备及用品250mL三角瓶三角瓶1个和个和100mL三角瓶三角瓶2个个 有盖试管有盖试管3支（支（1.515cm）和试管架）和试管架培养皿培养皿4个个 超净台超净台 移液器移液器 玻璃刮刀玻璃刮刀 酒精灯酒精灯 200mL烧杯烧杯1个个实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂2.材料材料50mL70%乙醇乙醇 100mL三角瓶中的配制好的三角瓶中的配制好的25mL全营养全营养LB固体培养基，固体培养基，加上封口膜后灭菌待用加上封口膜后灭菌待用 100mL三角瓶中的配制好的三角瓶中的配制好的25mL尿素固体培养基，加尿素固体培养基，加上封口膜后灭菌，待冷至上封口膜后灭菌，待冷至60时，加入通过时，加入通过G6玻璃漏玻璃漏斗过滤（使之无菌）后的斗过滤（使之无菌）后的10mL尿素溶液，摇动混合均尿素溶液，摇动混合均匀后待用匀后待用 3支有盖试管中均加入支有盖试管中均加入4.5mL蒸馏水后灭菌待用蒸馏水后灭菌待用 250mL三角瓶加入三角瓶加入99mL蒸馏水，加封口膜后灭菌待用蒸馏水，加封口膜后灭菌待用 土样土样1g（在有哺乳动物排泄物的地方取得）。（在有哺乳动物排泄物的地方取得）。三、实验教学具体技术操作问题三、实验教学具体技术操作问题（二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（1）琼脂和琼脂糖）琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖琼脂糖和和琼脂果琼脂果胶，胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：点是： 其主要成分不能被微生物利用；其主要成分不能被微生物利用； 可使培养基可使培养基固化固化； 不影响不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。培养基中其他营养物质被细菌吸收。本实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的本实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。筛选。（2 2）酸碱指示剂）酸碱指示剂尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解产生了脲酶的催化下分解产生了NHNH3 3，溶液会呈，溶液会呈碱碱性。性。（二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物酸碱指示剂是用来指示化学反应前后溶液的酸酸碱指示剂是用来指示化学反应前后溶液的酸碱性变化的。本实验中，酚红作为酸碱指示剂碱性变化的。本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4pH6.48.28.2，在酸性情况下呈，在酸性情况下呈黄黄色，碱性情况下呈色，碱性情况下呈红红色，色， （二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的分解，产生的分解，产生的NH3使培养基的使培养基的pH由原来的中由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用用尿素尿素的能力愈强。的能力愈强。（二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理 涂布分离时，需要先将菌液稀释，一般稀涂布分离时，需要先将菌液稀释，一般稀释到释到1010-5-51010-7-7之间，然后取之间，然后取0.1mL0.1mL的不同稀释的不同稀释度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再用度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再用消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在适当的稀释度下，可培养产生相互分开面，在适当的稀释度下，可培养产生相互分开 的菌落。通常每个培养皿中有的菌落。通常每个培养皿中有2020个以内的单菌个以内的单菌落为最合适。落为最合适。 将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，再做功能性实验。再做功能性实验。 （二）实验流程（二）实验流程 关键技术关键技术“涂布分离法涂布分离法”实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（1 1）制备空白）制备空白平平板：取板：取2 2个三角瓶，分别装个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养入已灭菌的全营养LBLB固体培养基和尿素固体固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至培养基，放在超净工作台上，冷却至60 60 左左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至至2 2个培养皿中（做两组，共个培养皿中（做两组，共4 4个空白平板），个空白平板），轻轻摇匀，平放至凝固。轻轻摇匀，平放至凝固。实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程（二）实验流程基本操作步骤基本操作步骤（2）制备细菌悬液：在无菌条件下，在将）制备细菌悬液：在无菌条件下，在将1g土样加到装有土样加到装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成，即成102土壤土壤稀释液，并依次制备出稀释液，并依次制备出103107稀释液。例如，若稀释液。例如，若想制备想制备10-6的稀释液，可取的稀释液，可取0.5 mL 10-5的稀释液。取样的稀释液。取样时，尽量只取悬液时，尽量只取悬液 ，倒入有，倒入有4.5 mL无菌水的有盖试管中，无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。摇匀，放在试管架上。实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程（二）实验流程基本操作步骤基本操作步骤 （3 3）涂布法分离细菌：在无菌条件下，分）涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取别取 0.1 mL0.1 mL的稀释度为的稀释度为1010-4-4和和1010-5-5的土壤稀的土壤稀释液（细菌悬液）释液（细菌悬液） ，分别加到装有全营养，分别加到装有全营养LBLB培培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；再将保存在再将保存在70%70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。菌悬液）均匀涂布到整个平面上。 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程（二）实验流程基本操作步骤基本操作步骤（4）将培养皿倒置摆放在）将培养皿倒置摆放在37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h，观，观察菌落数察菌落数 。实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程（二）实验流程基本操作步骤基本操作步骤实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物观察实验结果观察实验结果 与稀释度为与稀释度为1010-5-5相比，相比，LBLB培养基中的菌落数培养基中的菌落数在在1010-4-4处理中处理中 ，尿素培养基中的菌落数在，尿素培养基中的菌落数在1010-4-4处理中处理中 。 在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中的菌落数的菌落数 于于LBLB培养基中的菌落数，其原培养基中的菌落数，其原因是：因是： 。实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程（二）实验流程基本操作步骤基本操作步骤实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 一、课程标准对于本实验的要求一、课程标准对于本实验的要求实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）教材中实验内容安排（二）教材中实验内容安排1 1说出纤维素酶的作用，简述纤维素酶的应用价值。说出纤维素酶的作用，简述纤维素酶的应用价值。2 2说明培养基对微生物的选择作用。说明培养基对微生物的选择作用。3 3分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶的菌株，观察、分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶的菌株，观察、记录其对纤维素的分解作用。记录其对纤维素的分解作用。4 4体验能水解纤维素的微生物在环保中的意义。体验能水解纤维素的微生物在环保中的意义。 （一）需提前准备实验材料、仪器和试剂（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂1 1灭菌锅或高压锅灭菌锅或高压锅 2 2直径直径9cm9cm或或12cm12cm的培的培养皿、养皿、250mL250mL三角瓶三角瓶3 3自制保湿小室：有盖小玻璃缸（如鱼缸），自制保湿小室：有盖小玻璃缸（如鱼缸），内加入少量水即可内加入少量水即可4 480g80g草炭土或枯树周边的土草炭土或枯树周边的土5 5牛皮纸（牛皮纸（90cm90cm2 2）2 2张、卷烟纸张、卷烟纸6 6张张三、实验教学具体技术操作问题三、实验教学具体技术操作问题实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理(1)(1)纤维素酶及其作用纤维素酶及其作用 植物细胞壁中的主要化学成有纤维素、植物细胞壁中的主要化学成有纤维素、半纤维素半纤维素、果胶、木质素、蛋白质、水和外壳物质，其中纤维素果胶、木质素、蛋白质、水和外壳物质，其中纤维素是地球上最丰富的有机物质。在枯树或草炭土中有许是地球上最丰富的有机物质。在枯树或草炭土中有许多利用和分解这些物质作为能源的微生物，它们可分多利用和分解这些物质作为能源的微生物，它们可分泌纤维素，酶促分解纤维素，常用的泌纤维素，酶促分解纤维素，常用的产生纤维素酶产生纤维素酶的的微生物有微生物有绿色木霉、变异青霉、黑曲霉和根霉绿色木霉、变异青霉、黑曲霉和根霉等。等。 纤维素酶是一类酶的总称，可催化水解纤维素生纤维素酶是一类酶的总称，可催化水解纤维素生成成纤维二糖和葡萄糖纤维二糖和葡萄糖。纤维素酶包括酶。纤维素酶包括酶C C1 1酶、酶、C Cx x酶和酶和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 (2)(2)选择培养基对微生物的选择作用选择培养基对微生物的选择作用 选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们不需要的微生物的生长，促进人们需要的抑制人们不需要的微生物的生长，促进人们需要的微生物的生长。微生物的生长。本实验的目的是本实验的目的是分离并选择培养土壤中能分泌纤维素分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶的菌株，纤维素酶的菌株，纤维素是这类微生物可利用的碳源和能是这类微生物可利用的碳源和能源。源。 因为卷烟纸一般只含纤维素而不含其他物质，因因为卷烟纸一般只含纤维素而不含其他物质，因此，只有能分泌此，只有能分泌纤维素酶纤维素酶并以纤维素为碳源和能源并以纤维素为碳源和能源的微生物才能生长在卷烟纸上。的微生物才能生长在卷烟纸上。 实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理 (3) (3)用用“滤纸崩溃法滤纸崩溃法”测定纤维素酶的活测定纤维素酶的活性性 一定大小的滤纸在纤维素酶的作用下，滤一定大小的滤纸在纤维素酶的作用下，滤纸逐渐被破坏，以滤纸的破坏速度表示酶活纸逐渐被破坏，以滤纸的破坏速度表示酶活性的大小，即性的大小，即滤纸滤纸破坏速度越快，纤维素酶破坏速度越快，纤维素酶活性越大。活性越大。 实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程基本原理基本原理实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程实验基本操作步骤实验基本操作步骤1、取两个、取两个250mL三角瓶编为三角瓶编为1、2号，号，1号倒号倒入入100mL自来水；自来水；2号放入一半土壤号放入一半土壤（40g）；再将）；再将2个空培养皿编为个空培养皿编为1、2号，号，然后用牛皮纸包好。然后用牛皮纸包好。将上述物品放入灭菌锅，在将上述物品放入灭菌锅，在1000g/cm2 压压力下，力下，121灭菌灭菌30min，如在高压锅中灭，如在高压锅中灭菌则需菌则需1h。赵金秋（西城教研） 摄(2)(2)取灭菌后的培养皿，取灭菌后的培养皿，1 1号放入号放入灭菌土壤灭菌土壤，2 2号放入号放入未灭菌土壤未灭菌土壤。如土壤湿度不够，需加入。如土壤湿度不够，需加入一些一些1 1号三角瓶中灭菌后的自来水号三角瓶中灭菌后的自来水 。(3)1(3)1、2 2号培养皿的土壤表面上均放在号培养皿的土壤表面上均放在3 3张张 纸，尽量使土壤与纸接触。培养皿不加盖，但纸，尽量使土壤与纸接触。培养皿不加盖，但用纸盖上保湿。用纸盖上保湿。最后将两个培养皿放在最后将两个培养皿放在较高湿度较高湿度的环境中，如的环境中，如自制的保湿小室。自制的保湿小室。实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程实验基本操作步骤实验基本操作步骤观察实验结果观察实验结果 4 46 6周后观察两个培养皿的变化，其中周后观察两个培养皿的变化，其中1 1号号培养皿中的卷烟纸基本无变化培养皿中的卷烟纸基本无变化 ，2 2号培养皿中号培养皿中的卷烟纸完全消失的卷烟纸完全消失 。 总结实验结论总结实验结论 在土壤中存在可分泌在土壤中存在可分泌纤维素酶的微生物。纤维素酶的微生物。 实验实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物观察土壤中能分解纤维素的微生物 （二）实验流程（二）实验流程实验基本操作步骤实验基本操作步骤 本单元评价方式建议本单元评价方式建议小结微生物提纯培养的方法，指导学生完成实验报告。实小结微生物提纯培养的方法，指导学生完成实验报告。实验报告应该包含实验题目、实验目的、实验材料用具、实验报告应该包含实验题目、实验目的、实验材料用具、实验步骤、实验结果、分析讨论等。实验结果可以附以照片验步骤、实验结果、分析讨论等。实验结果可以附以照片加以说明。为加强纪律管理，还可加入学生对整个实验过加以说明。为加强纪律管理，还可加入学生对整个实验过程的自评和互评。程的自评和互评。本单元评价方式建议本单元评价方式建议自评自评互评互评师评师评ABCABCABC工作态度：工作态度：实验全过程能与他人配实验全过程能与他人配合，合，积极参与积极参与 ，动手动脑，动手动脑实验效果：实验效果：能客观记录实验现象，能客观记录实验现象，实验效果理想实验效果理想讨论分析：讨论分析：能积极参与实验结果的能积极参与实验结果的交流讨交流讨