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具体的操作步骤是,RNA提取,随机引物反转录,反转录产物10倍稀木I, real-time PCR.这个是标准的两步法。一步法是把反转录和扩增联合起来做,不推荐使用。具体的注意事项有1:高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调 RNA降解,而是强调 RNA的纯度,不能含有基因组 DNA,以及其他 杂质污染。基因组 DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理,消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制 real-time PCR的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以 RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的 RNA 以同样的速度降解,而相对比率不会改变。2:减少加样误差, 在使用SYBR Green MIX 的时候,一定要先按照反应的量(比如 8个孔)把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反应体系给模板,为什么要使用5微升,是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。3。选择合适的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因, 找到变化最小,最稳定的一个。4。合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等等Q-PCR实验流程1、 实验前准备, 每天早上到实验室后, 先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镣子,不可以用使用过的 手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。橡胶手套须放入超净 台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台, 移液器 在一天工作结束后调至最大量程, 并用 75% 乙醇清洁移液器, 枪头盒及超净台面。 实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。2、 总 RNA 抽提1)细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后, 用 1ml 枪将 PBS 吸干净,加入 1ml Trizol ( invitrogen )溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitro gen)溶液,混匀,室温放置 5min 使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称 )2)加入200区氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置 3-5min;( 离心时 离心管 按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致)3) 4下,14,000g 离心 15min ,可见分为三层, RNA 在上层水相,移至另一个新的 RNase free EP 管 ;(用 20-200ul 的枪吸取上清, 吸上清时, 枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层 )4)沉淀 RNA :加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8 次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5)4 C下,14,000g离心10min ,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管 底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4 c下,14,000g离 心10min ,收集RNA沉淀),去上清;6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或 过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase ?(Promega),按以下体系配置反应液,37 c 消化 30min , 65 c 灭活 10min。RNA?30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasin0.5总体积100然后按以下步骤操作:1)加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置 5min,后 14,000rpm ,离心 15min ,取上清。2)加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm ,离心15min ,取上清。3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20C静置15min;4)4 C下,14,000g离心15min ,收集RNA沉淀,去上清;5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测:取1 RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定 OD 值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2)总RNA完整性检测:取RNA样品1口1%琼脂糖凝胶电泳80Vx20min , EB染色10min ,用凝胶成像系统观察并拍照,总 RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总 RNA 抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA :Total RNAH2O1.0闵d总体积121)在RNase free的PCR管中配置下列溶液.2)将上述溶液吹打均匀,置85 c保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性;3)在该PCR管中加入下列试剂(Promega)oligo (dT)0.5Random primer0.510mM dNTP2.0RNase inhibitor0.55 x buffer4.0M-MLV0.5总体积8.04)将上述20 w反应7液30 c保温10min;5) 42 c保温 50min;6) 85 c 保温 10min;7)-20 C 保存。2. microRNA :使用茎环逆转录法,原理如下图:1)在去RNase的PCR管中配置以下溶液.total RNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*X闻总体积12.52)将上述溶液混匀,85 c孵 育5min ,以打开RNA二级结 构。随后立即置于冰上,以防止 RNA复性再次恢复二级结构;3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mM dNTP (promega)2.0RNase inhibitor (promega)0.5U6逆转录引物0.55x buffer4.0M-MLV (promega)0.5总体积7.54)将3)溶液加入到1)溶液中,混匀后30c保温10min;5) 42 c孵育 50min;6) 85 c孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1 .引物测试:根据mRNA设计的引物正式实验前需进行 qPCR测试其特异性和扩增 效率,具体反应体系和反应条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且 峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲 线均显示特异性良好,则应对比各引物的扩增曲线,优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2 .确定上机内容后,首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。(1) 一 个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板3 .正式实验:体系配制:H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)( 使用前需振荡均匀 )上游引物0.5ul (10uM)下游引物0.5ul (10uM)总体积 15ul计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。体系分装会有损失,一般多配 0.5 份-1 份体系。总的体系配好后, 在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀, 然后 15ul 每管分装至 8 连管中。4 .cDNA 用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为 1:20 稀释,如遇到基因表达低的样品, 则适当降低稀释比例至1:10 或 1:5。 cDNA 按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12 的顺序 (不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。 )5 .把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。6 .上机:5.1 先开电脑,进入Windows 界面。接着打开PCR 仪电源开关。5.2 打开7500软件,选择 新建”,在“Template下拉菜单中选择“6瞰“ 65”(普通基因检测为“ 60,” MicroRNA 检测为“ 65”)5.3 打开样品架,放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位。5.4 点击 File 菜单中 Save ,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如100830-1008-WL 表示 8 月 30 日 10 点 08 分魏立的实验。5.5 点击 Start 键,开始运行程序。5.6 程序运行完毕后,取出样品架上的八连管,按顺序关闭 ABI PRISM 7500 SDS 软件、 PCR 仪电源开关。5.7 在 7500 软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称,分类保存好结果文件。反应完成后,八连管应装到封口袋中,袋子上标记好文件名,客户的名字。( 同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可,其余可丢弃 )
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