qPCR操作步骤

具体的操作步骤是，RNA提取，随机引物反转录，反转录产物10倍稀木I, real-time PCR.这个是标准的两步法。一步法是把反转录和扩增联合起来做，不推荐使用。具体的注意事项有1:高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调 RNA降解，而是强调 RNA的纯度，不能含有基因组 DNA,以及其他 杂质污染。基因组 DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制 real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因，所以 RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有的 RNA 以同样的速度降解，而相对比率不会改变。2：减少加样误差， 在使用SYBR Green MIX 的时候，一定要先按照反应的量（比如 8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，为什么要使用5微升，是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。3。选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因， 找到变化最小，最稳定的一个。4。合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等等Q-PCR实验流程1、 实验前准备， 每天早上到实验室后， 先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镣子，不可以用使用过的 手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净 台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台， 移液器 在一天工作结束后调至最大量程， 并用 75% 乙醇清洁移液器， 枪头盒及超净台面。 实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。2、 总 RNA 抽提1）细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后， 用 1ml 枪将 PBS 吸干净，加入 1ml Trizol （ invitrogen ）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitro gen）溶液，混匀，室温放置 5min 使其充分裂解;（管盖与管壁都需标记样品名称 ）2）加入200区氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min;（ 离心时 离心管 按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4下，14,000g 离心 15min ，可见分为三层， RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管 ;（用 20-200ul 的枪吸取上清， 吸上清时， 枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层 ）4）沉淀 RNA ：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8 次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min;5）4 C下，14,000g离心10min ,收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管 底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4 c下，14,000g离 心10min ,收集RNA沉淀），去上清；6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或 过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下体系配置反应液，37 c 消化 30min , 65 c 灭活 10min。RNA?30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasin0.5总体积100然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min,后 14,000rpm ,离心 15min ,取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm ,离心15min ,取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20C静置15min;4）4 C下，14,000g离心15min ,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）,超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1）纯度检测：取1 RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD 值，OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取RNA样品1口1%琼脂糖凝胶电泳80Vx20min , EB染色10min ,用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总 RNA 抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA :Total RNAH2O1.0闵d总体积121）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.2）将上述溶液吹打均匀，置85 c保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性；3）在该PCR管中加入下列试剂（Promega）oligo (dT)0.5Random primer0.510mM dNTP2.0RNase inhibitor0.55 x buffer4.0M-MLV0.5总体积8.04）将上述20 w反应7液30 c保温10min;5） 42 c保温 50min;6） 85 c 保温 10min;7）-20 C 保存。2. microRNA :使用茎环逆转录法，原理如下图：1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液.total RNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*X闻总体积12.52）将上述溶液混匀，85 c孵 育5min ,以打开RNA二级结 构。随后立即置于冰上，以防止 RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega)2.0RNase inhibitor (promega)0.5U6逆转录引物0.55x buffer4.0M-MLV (promega)0.5总体积7.54）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30c保温10min;5） 42 c孵育 50min;6） 85 c孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1 .引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行 qPCR测试其特异性和扩增 效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且 峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲 线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2 .确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1） 一 个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3 .正式实验：体系配制：H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)( 使用前需振荡均匀 )上游引物0.5ul (10uM)下游引物0.5ul (10uM)总体积 15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配 0.5 份-1 份体系。总的体系配好后， 在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀， 然后 15ul 每管分装至 8 连管中。4 .cDNA 用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20 稀释，如遇到基因表达低的样品， 则适当降低稀释比例至1:10 或 1:5。 cDNA 按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12 的顺序 (不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。 )5 .把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。6 .上机：5.1 先开电脑，进入Windows 界面。接着打开PCR 仪电源开关。5.2 打开7500软件，选择 新建”，在“Template下拉菜单中选择“6瞰“ 65”（普通基因检测为“ 60，” MicroRNA 检测为“ 65”）5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4 点击 File 菜单中 Save ，输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL 表示 8 月 30 日 10 点 08 分魏立的实验。5.5 点击 Start 键，开始运行程序。5.6 程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭 ABI PRISM 7500 SDS 软件、 PCR 仪电源开关。5.7 在 7500 软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。（ 同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃 ）