二氢杨梅素抗肿瘤最新研究进展

二氢杨梅素抗肿瘤最新研究进展刘斌 练添明 朱润芝广东医学院肝胆外科研究室 湛江市肝胆相关疾病重点实验室摘要: 二氢杨梅素是黄酮类化合物之一，大量存在于藤茶植物中。研究表明二氢杨梅素具有抗肿瘤、清除自由基、抗氧化、抗血栓和消炎等多种功效1-3。本文主要综述二氢杨梅素抗肿瘤活性和5种抗肿瘤作用机制:诱导肿瘤细胞凋亡；诱导肿瘤细胞自噬；抑制肿瘤细胞侵袭、转移；抑制肿瘤血管形成以及细胞周期阻滞。二氢杨梅素在体外和体内抗肿瘤方面效果明显，其对抗肿瘤药物的研究具有重要意义。关键词：二氢杨梅素；肿瘤；自噬。Abstract: Dihydromyricetin is one of the flavonoids, abounding in rattan tea plants. Studies have shown that dihydromyricetin has anti-tumor, scavenging free radicals, antioxidation, antithrombotic and anti-inflammatory effect1-3. This article mainly reviews dihydromyricetin antitumor activity and 5 kinds of antitumor mechanisms: The function of inducing tumor cell apoptosis, the function of inducing tumor cell autophagy, inhibition of tumor cell invasion and metastasis, inhibition of tumor angiogenesis and cell cycle arrest. Dihydromyricetin in vitro and in vivo antitumor effects are obvious, having significance in antitumor drug research, especially.Keywords: Dihydromyricetin; Tumor; Autophagy1. 二氢杨梅素的来源和理化性质二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DMY)是一种多酚羟基双氢黄酮醇(图1)，该化合物首次由Kotake和Kubota于1940年从葡萄科蛇葡萄属植物福建茶即楝叶玉葡萄(A1Meliaefolia)的叶中分离得到，命名为蛇葡萄素。1996年周天达等4从藤茶的茎叶中再次分离得到该化合物，并命名为DMY。研究表明藤茶茎叶中DMY含量可达30%以上5。藤茶属葡萄科，蛇葡萄属，学名为显齿蛇葡萄(Ampelopsis gross edentata)，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物,主要分布于云南、广西、广东、江西、湖南、贵州、湖北、福建等海拔4001300米的山地灌丛中、林中、石上、河边6。野生贮量大，易于采摘，提取技术成熟，是极为丰富和可利用的野生植物资源。DMY提取物为白色针状结晶（乙醇），常温下不易溶于水，易溶于热乙醇及丙酮，溶于乙醇、甲醇，极微溶于醋酸乙酯，不溶于氯仿、石油醚。研究表明二氢杨梅素热稳定性较好，但随着温度的升高，大于100二氢杨梅素会发生不可逆的氧化反应。二氢杨梅素在中性和偏酸性条件下稳定7。图1. 二氢杨梅素结构式2. 二氢杨梅素抗肿瘤活性2.1对肿瘤细胞的体外抑制作用 从体外细胞活性抑制实验结果看, 二氢杨梅素对人肝癌HepG2细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、和肺癌AGZY-83-a细胞都有较强的抑制作用。吴士兴等8采用MTT法和LDH检测二氢杨梅素对细胞活性的影响，结果表明二氢杨梅素抑制HepG2细胞增殖呈时间和浓度依赖关系。二氢杨梅素作用HepG2细胞24小时，由GRAFIT-Erithacus IC50软件测得，半数抑制浓度为168 uM。周防震等9研究发现DMY处理48 h后，其抑制HepG2细胞增殖呈时间和浓度依赖关系，IC50约为73.6 mg·L-1。尹梅梅等10研究肺癌AGZY-83-a细胞，发现二氢杨梅素12.5、25.50、100和200 umol·L-1作用于肿瘤细胞24 h后，细胞的抑制率分别为3.8%±0.02%、10.9%±0.9%、15.2%±1.2%、26.7%±1.7%和39.1%±2.8%；而当药物浓度在200umol·L-1，分别作用12、24、48、72 h后，对细胞的抑制率分别为24.5%±4.3%，39.1%±2.8%，68.4%±518%和86.7%±4.2% (n=8,P<0. 05)。 2.2 二氢杨梅素体内抑制肿瘤的效果曾飒等11研究发现，二氢杨梅素对人肺癌 GLC 82裸鼠移植瘤有显著的抑制作用，药物高、中、低剂量组的肿瘤生长抑制率（IR）分别为37.1%、14.1% 和 26.8%，相对肿瘤增殖率（T/C）分别为57.71% 、72.37%和73.68%。周防震等研究4T1乳腺癌细胞Balb/C雌性小鼠体内移植肿瘤模型，观察二氢杨梅素和阿霉素（ADM）单用以及联合干预对小鼠移植瘤重、肺部转移灶和心肝毒性的影响。发现ADM对小鼠移植性4T1乳腺癌生长和肺转移有明显的抑制作用，但伴随一定程度的心、肝毒性，DMY对ADM的抗肿瘤作用具有增效减毒作用。3 二氢杨梅素抗肿瘤机制3.1诱导肿瘤细胞凋亡P53蛋白通过Bax/Bcl2、 Fas/Apol和IGF-BP3 等蛋白，可完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c 的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。吴士兴等应用膜联蛋白/碘化吡啶双重染色、流式细胞仪观察HepG2细胞凋亡情况,分别用0、10、100 uM的二氢杨梅素处理HepG2细胞24 h，凋亡计数结果分别为15.1%、19.5%和56.5%。分别用50 uM的二氢杨梅素处理HepG2细胞3、6、12、24和48h，并且使用用0、10、25、50、100和50 uM的二氢杨梅素培养液孵育HepG2细胞12 h，Western Blot结果均显示，P53蛋白浓度逐渐升高，Bcl-2蛋白浓度逐渐下降，而Bax蛋白浓度几乎不变。由此说明二氢杨梅素通过上调P53蛋白下调Bcl2的浓度，最终诱导凋亡。Yang J12研究发现，二氢杨梅素与羟丙基-环湖精的混合物提高了药物的水溶性和化学稳定性，不但使细胞周期发生明显改变，而且还诱导HepG2细胞的凋亡。3.2诱导肿瘤细胞自噬LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。Beclin1是另一个检测凋亡生化指标，对早期凋亡的监测有重要意义。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是磷脂酰激酶3（PI3K）家族成员之一，在调节细胞生长和增殖过程中扮演重要角色，通过连接上游细胞信号形成复杂的细胞网络调控自噬。还有研究认为雷帕霉素靶蛋白抑制自噬的起始13-14。夏娟等15研究发现二氢杨梅素通过抑制雷帕霉素靶蛋白和调节其上游通路诱导HepG2细胞自噬。分别用浓度为0、10和50 uM的二氢杨梅素处理HepG2细胞24 h，在透射电镜下可以清晰的看见，随着药物浓度增加，自噬溶酶体积累越多。二氢杨梅素抑制雷帕霉素靶蛋白的激活，肝癌细胞在不同的处理时间和浓度孵育，细胞裂解后提取蛋白，Western Blot 分析mTOR、S6k、PI3K、Akt、ERK1/2和AMPK的表达水平，结果发现mTOR、PI3K和AMPK表达水平随着DMY浓度的升高和作用时间的延长而上升，而Akt、p-Akt-Erk和p-Erk表达水平趋势与之相反，mTOR下游靶蛋白S6K的两个亚型P70s6k和P85s6k无明显变化，自噬蛋白Bclin1和LC3-的表达也具有时间-浓度依赖关系。3.3 抑制肿瘤细胞侵袭、转移肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞从其起源部位延组织间隙向周围正常组织扩张性增生的过程。其标志是突破基底膜和细胞外基质构成的屏障，侵犯毗邻的正常组织。而转移即恶性肿瘤细胞通过浸润在周围间质中生长，借助血道、淋巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位的器官内形成继发瘤的过程16。郑宏强等17研究发现蛇葡萄素具有抑制黑色瘤的侵袭和转移的作用。经20、40和80 umol/L蛇葡萄素处理后，其对B16细胞侵袭人工基底膜的抑制率分别为36.06%、59.58%和79.09%（P<0.01）对细胞的趋化运动抑制率分别为51.59%、56.51%和66.75%（P<0.01）；显著降低B16细胞与基质成分层粘连蛋白、纤维粘连蛋白及Matrigel的作用。周防震等18研究发现二氢杨梅素可抑制乳腺癌细胞侵袭和下调MMP-2/-9的蛋白水平。在Transwell模型中，分别用10、20和40 mg/L的二氢杨梅素孵育MDA-MB-231细胞，发现其迁移量占对照组的百分比分别为65.4%、53.1%和17.7%。免疫印迹发现，侵袭相关蛋白MMP-2/-9水平下降与二氢杨梅素有浓度依赖关系。刘德育等19研究蛇葡萄素体内外对小鼠B16黑色素瘤侵袭和转移的抑制作用时，发现20、40和80 umol/L的蛇葡萄素对B16细胞的侵袭和运动能力都具有显著抑制作用。3.4抑制肿瘤血管形成在肿瘤生长过程中，无论肿瘤转移的起始或终末阶段，血管生成均发挥至关重要的作用20。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知活性最强、特异性最高的血管生成因子，有效调节肿瘤血管形成21。肿瘤细胞过度分泌VEGF、肿瘤血管内皮过度表达其受体(VEG-FR)，促进肿瘤血管生成和肿瘤转移。阻断VEGF与VEGFR的相互作用，可抑制肿瘤内皮细胞生长和血管生成，最后阻止肿瘤的生长和转移。罗高琴等22在研究蛇葡萄素的血管生成抑制作用时，用ELISA法测定结果显示，12.18 Lg /ml、25.16 Lg /ml和38.14 Lg /ml蛇葡萄素对肝癌Bel- 7402细胞分泌VEGF的抑制率分别为14.12%、40.10%及49.16%。免疫组化染色结果显示，12.18 Lg /ml以上的蛇葡萄素能使细胞体积缩小，分泌VEGF和bFGF明显减少。蛇葡萄素可有效抑制人肝癌Bel-7402裸鼠移植瘤的增殖，蛇葡萄素的这些作用可能与其能有效抑制内皮细胞的增殖、抑制人肝癌Bel-7402细胞VEGF及bFGF的表达。3.5细胞周期阻滞细胞周期是由一系列调控机制所调节的，包括周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依赖性激酶(CDKs)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)，以确保细胞周期严格有序地交替和各时相依次有序变更23 。二氢杨梅素属于黄酮类物质，具有黄酮类物质的一般特性。目前已有许多证明,多种黄酮类化合物可诱导多种肿瘤细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡24。据报道黄酮能以剂量依赖方式有效地抑制人肺腺瘤A549细胞生长，使细胞周期阻滞于G1期,机制是黄酮能明显提高细胞周期依赖蛋白激酶抑制因子-p21/WAF1的mRNA及蛋白质水平，且p21/WAF1的增加是p53非依赖性的,同时抑制视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的磷酸化25。4 结语目前化疗依然是治疗恶性肿瘤的主要方法之一, 然而化疗药物的毒副作用可严重影响患者的精神、体力、食欲等, 更严重的是产生肝肾功能损害等一系列毒副作用及并发症，患者生活质量差。另一方面，长期使用抗癌药物容易产生耐药性，且单一的治疗不能完全控制其发展, 需要更多的可选择药物。因此，降低化疗药物的毒副作用进而提高疗效已成为肿瘤治疗的一个主要研究方向。低毒、高效的植物提取物,是目前世界上肿瘤治疗的发展趋势。许多植物黄酮类物质在肿瘤防治方面具有重要作用,取得了良好的疗效, 且没有交叉耐药性, 如姜黄素和杨梅素。近几年二氢杨梅素的研究国外报道较少。目前对二氢杨梅素的研究主要集中在离体条件下的肿瘤细胞增殖抑制和细胞毒作用研究26，鲜有动物实验证据,对其机制研究也主要在促进凋亡、自噬以及抑制迁移等传统途径方面，且对相关通路研究不完全。据目前研究表明，二氢杨梅素具有作为抗癌药开发利用的具大潜力27，一些通路也逐渐得以揭示，为充分理解其药物作用机制及疗效提供理论基础。因此研究DMY抗癌作用对于开展癌症综合防治具有重要的理论和应用价值。参考文献1陈玉琼, 倪德江, 程倩, 等. 藤茶总黄酮及二氢杨梅素降血脂作用研究J. 茶叶科学, 2007, 27(3): 221-225.2李翠苹, 曹树稳, 等.二氢杨梅素研究进展. 化学试剂, 2010, 32(7): 608-612.3徐静娟, 姚茂君, 许钢. 二氢杨梅素抗氧化功能的研究J. 食品科学, 2007, 28(9): 43-45.4周天达, 周雪仙. 藤茶中双氢黄酮醇的分离, 结构鉴定及其药理活性J. 中国药学杂志, 1996, 31(8): 458-461.5 张友胜, 杨伟丽, 崔春. 显齿蛇葡萄化学成分的研究J. 中草药, 2003, 34(5): 402-403.6 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