血凝仪器发展解析

Sysmex 株式会社 CA 系列全自 动凝血分析仪几乎所有检测血液凝固的现有基本原理都是在1900年的前半年提出的，但现代止血与血栓分析仪器的雏形出现于50年代。当时对于止血/血栓的检测完全依赖人工方式，由于这种方法不同检验员得 到的测试结果差别较大，同时要求检验员具有很高的操作熟练程度， 因此，迫切需要实现测试的自动化。在这种理念下，开发出了最早的 运用电流法原理的半自动化操作仪，其主要还是模拟手工凝固时间的 测定方法。60年代出现了光学浊度法的凝血仪。但是，血凝仪的真 正发展与普遍使用乃是始于微电子技术、免疫化学技术迅速发展的 70-80年代，使运用光学浊度法的血凝仪日趋完善。一系列血液凝固 自动测试仪的开发，使得止血/血栓的检测更为准确、迅速，显著提 高了实验的精度。Sysmex株式会社(日本希森美康株式会社)，原名日本东亚医 用电子株式会社(TOA Medical electronics Co.LTD),是一家集先进的 血球计数仪、尿沉渣分析仪与凝血仪生产于一体的跨国公司，素以产 品精湛、技艺超群而闻名于世。本公司致力于研究开发全自动凝血仪， 并于1984年首次推出了 CA-100凝血分析仪以来，有 CA-3000、 CA-4000、CA-5000、CA-1000、CA-6000、CA-500、CA-1500、CA-50 及CA-7000等一系列CA产品陆续投放市场。公司生产的全自动凝血 分析仪因品种繁多、性能卓越而受到广大检验工作者的普遍欢迎，能 满足不同层次使用单位的要求，在众多同类产品中成为凝血机制检查的首选。尤其欣慰的是，Sysmex公司与Dade Behring公司长期合作, 实现了试剂优选的目标。强强联手，真正地将凝血机制的实验室检查 推进到了一个崭新的阶段。以下对 CA各系列产品作一介绍。Sysmex公司在血液凝固分析仪器领域中最初上市的产品CA-100是一种单通道的半自动仪器。引进微电子技术后，对异常标 本也能进行高性能的测试，同时具有操作简便的优点。因此，目前该 技术仍应用于许多设备中。本仪器的测试原理采用了光学法中的散射 比浊法，主要是根据待测样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测 终点。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90。直角，当标本中加入凝血激活剂时，起初在标本中并未发生很大的散射光变化， 随着反应的进行，纤维单体的聚合作用加速，反应液产生白浊现象， 从而使散射光强度增加。用超高辉度二极管（光源 660nm）照射上述 反应液，将90。角方向的散射光量转换为电信号，并将信号的变化描 绘成凝固曲线，当标本完全凝固以后，散射光量不再变化。另外，仪 器还采用了百分比终点测试法，即把标本中加入试剂后最初散射光量 设为0%,把反应结束后不再变化的散射光量设为 100%,并将与50% 散射光量相对应的时间作为凝固时间进行测定。50%的部位是单位时间内散射光量的变化最为显著、纤维蛋白的单体聚合反应速度最快的 部位。由于引入了百分比终点测试的方法，预先扣除了标本、试剂的 本底，然后再检测由于凝固而致的散射光强度的变化， 因此即使对于 临床常见的最初光量水平较高的溶血性标本、黄疸、脂血标本，或者 散射光强度较低的低纤维蛋白标本， 均能进行更准确的测定，具有较 强的抗本底干扰能力（图1）。所有CA系列的血液凝固分析法均采用 了这种测试方法。1985年和1986年公司相继开发了全自动血液凝固分析仪 CA-3000和CA-4000。CA-3000不仅将检测部增加到 8个通道，大大 提高了处理标本的能力，而且还实现了投放试剂的全自动化。CA-4000通过安装具有冷却功能的取样器，实现了标本抽取和投放的 全自动化。标本吸移管上设有液面感应器，因此，离心操作之后不必 进行分离，在保持其原状态的条件下，只抽取上面的血浆，从而大大 地减少了标本的前处理时间，使凝固测试变得更简便。1990年Sysmex公司开发出全自动血液凝固分析仪 CA-5000 ,它 使直到当时CA系列一贯采用的试剂和血浆量（与人工测试法等量） 半量化，大幅度地降低了检测成本。从此，试剂和血浆的半量化成为 血液凝固分析领域里的主要趋势。 另外，CA-5000还可同时测定5项 参数，真正实现了高速处理。CA-5000的研制成功使Sysmex公司在 国内凝固测试仪器领域中占据了领先地位。1992年，为实现仪器的中、小型化，公司又开发出将CA-5000进一步小型化的产品CA-1000。在中国，广泛使用CA系列血液凝固分析仪是从1997年Sysmex 公司开发的CA-6000开始的，下面对这一系列在中国应用最普遍的 仪器作详细介绍。CA-6000在凝固法的基础上有应用了发色底物法和免疫法测定 原理。一、基于发色底物法的测试系统用于酶的测定，它包括下列两种方 法：即在蛋白酶和发色底物进行一定时间的反应后一一1、用反应终止液使反应停止，将此时的吸光度作为绝对量用比色计测定，从而求出其活性量的终点法。2、将一定时间内的吸光度变化量作为反应速度，从而求出其活性 的动态法。所需试剂种类及试剂添加量较少的动态法广泛应用于自动测试中。 CA-6000采用该种动态法进行全自动测试，其原理是：通过人工合 成与自然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序、还有特定作用位点 的小肽，并将可水解产色的化学基团一一对硝基苯胺（PNA）与作用 位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不仅能作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽链底物，从 而释放出PNA基团，使颜色呈黄色，产生颜色的深浅与凝血因子活 性成比例关系。通过光纤，从卤素灯光源将波长为405nm的光源射到受检标本，然后对透射光进行检测，求出一定时间内的吸光度变化， 并根据标准校正曲线，计算出所测物质的活性百分比值。二、免疫法采用乳胶凝集法。根据此法可测定FDP/FgDP和作为继 发纤溶分子标记物之一的D-dimer。乳胶凝集法采用的是将与待测物 质相对应的抗体包被在乳胶颗粒上， 然后与被检物结合，形成抗原抗 体复合物的乳胶颗粒凝集，使透射光强度发生变化。同时利用形成复 合物的时间与抗原量之间的正比关系、 凝集速度与抗原量之间的正比 关系，从单位时间内颗粒凝集引起的光学变化量求出抗原量。运用免疫法，有时在分析过程中产生光量变化下降的前驱现象，CA-6000可以通过分析与反应初期的反应速度之比检测出这些现象。进行该测试 时，通过更换发色底物单元的滤波器可以改变测试波长。用 575或 800nm的光照射标本，并检测透射光，求出单位时间内的吸光度变化。除此之外，CA-6000的试剂定量采用精度更高的注射式代替了过去 的泵式，试剂和血浆的搅拌方式改用更加可靠的电动机振动搅拌代替 过去的试剂吐出搅拌，使混匀更充分，并能避免气泡的产生。这些措 施显著地提高了数据的准确性，此后的CA系列产品均采用了这些方 式。1997年，Sysmex公司研制出能够进行凝固法和发色底物法全自动 测试的CA-500系列。这是一种可进行全自动测试的小型产品， 虽然 所测标本数目不多，但对于多项参数的测试非常有效，是一类“低成 本、高效益、实行微量法测试”的台式化仪器。它不仅适用于常规筛 选检查，也可用于确诊的精密检查，并可灵活运用于夜间急诊以及研 究工作。CA-500系列主要包括四种机型：CA-510、CA-520、CA-530、 CA-540。（区别见下表）发射底物法装置试剂冷却器条形码识别器CA-510选购件CA-520有CA-530有有选购件CA-540有有有该系列除了采用凝固法对 PT、APTT、Fbg、TT四个基本检验项目进行测试外，CA-530/CA-540采用发色底物法对AT-m进行测 试，测试方法均为分离式实时随机方式，通过程序化软件，还可完成 对其它项目的测试任务。在对纤维蛋白原定量时可选择经济实用的“PT演算法”和国际标准的CLAUSS法进行测定。自动稀释功能对 于高浓度的纤维蛋白原或低浓度纤维蛋白原异常标本，可通过设定自动稀释比率获取准确的测试结果，这些都保证了结果的高精密度与高 准确性。CA-500 系列在自动化方面，可以自动进行标本及试剂的取出与 注入、预温和测试，装有10个试管的试管架可以简单地装进自动进 样机，并且可以通过更换试管架来持续传送标本。自动稀释功能确保了纤维蛋白原测定的可靠性，而STAT位的设置，可以完成随时对紧 急标本的优先测试；CA-500系列的低成本、高效益性表现在真正实 现了全自动操作，大大节省了时间，提高了化验室的检验效率。该系 列采用半量化测试与注射器吸引方式，从而降低了试剂的消耗。由于试剂托盘可移动，在测试前后均可将试剂放在冰箱里保存，同时 CA-530/CA-540还配有试剂冷却功能，达到了节省试剂的目的；在安全性方面，由于融合了诸如自动进样、全封闭式检验以及自动处 理试管等功能，从而大大降低了接触感染的危险性。 试剂与样品针的 撞针自动检测报警功能也增加了使用的安全性。1998 年，Sysmex公司为了提高CA-6000 的操作性，通过改 进程序，开发出了 CA-1500 ,实现了多功能和高速处理。该仪器采 用了凝固法、发色底物法和免疫法3种检测技术，测定血浆中的凝血、 抗凝和纤溶的多项参数。凝固法原理检测时，由于先进的光学散射比浊法与百分比终点测试法相配合，解决了高脂、黄疸和溶血对凝固时 间测定的干扰（见中华医学检验杂志 1999年22卷第5期），并可 测出低纤维蛋白原样品的凝固时间。在对纤维蛋白原浓度定量时可选 择经济实用的“ PT演算法”和国际标准的CLAUSS法进行测定。它 采用了全自动多浓度稀释分析方法（Multi Dilution Analysis,MDA ）, 不同稀释度的测试结果所呈现的线性范围，由于标准曲线呈平行状态的平行线图象显示来支持，即平行线生物学分析功能，可以充分保证 凝血因子分析结果的高度准确性，并有助于鉴别抑制物的活性状况。CA-1500除了采用X或L-J质控方法外，还采用了一种新型的多规 则质控方法 Westgard方法，拥有20个质控文件。这些都使检 测结果的可靠性方面有了保证。CA-1500 具有快捷的检测能力，检测 PT时可达120个测试/小 时，多项指标联合测定为80个测试/小时。它实现了全能的随机分 析：在标准曲线制作、检测质控品和常规标本时，能对 15项常见参 数（PT、APTT、TT、Fbg、AT3、plg、H、V、叼、X、叩、IX、 XI、刈、D-dimer ）进行随即分析。另外，附设 5个STAT专用检 测位，可用于急诊标本的优先检测。同时具有自动再检功能、自动连 锁筛选功能：对于结果超出实验室预设范围的标本，它可自行再（或 无需）稀释后再检测。结果确实异常时，在综合分析的基础上，相应 地自动进行下一步测试，以进一步提供异常标本的相关信息。打开或关闭的测试管可以同时设置在进样机上，而原始管免开盖穿刺式吸 样，都大大提高检测效率和安全性。CA-1500 为一台开放式全自动凝血分析仪，表现在编程功能上的 极具灵活性，可使用自行编制的测试程序来完成不同测试任务。 而它 拥有的通讯环境的广泛适应性则体现在供选配的 ID条码阅读机、打 印机和主机的种类的多样性上，如将CA-1500与全自动离心机标本 架输送系统相连，可以形成自动化凝血检查系统，还可以在标准系统 上再添一台CA-1500 ,进一步提高标本的处理能力。据上海瑞金医院实验研究表明，CA-1500血液凝固分析仪在应用 Dade公司试剂系统的条件下，具有很高的批内和批间检测重复性， 良好的测定线性和较强的抗生物干扰能力以及与 ACL-3000plus 血 液凝固分析仪的良好相关性。它不但能满足目前临床常规血液凝固指 标检测的需要，而且对设定新的止血和血栓检测指标也具有较大潜 力。（见中华医学检验杂志1999年22卷第6期）1999 年，Sysmex 公司推出了 CA-100 的改型产品CA-50和 目前世界上性能最优越，综合采用各种最新技术的CA-7000 。CA-50是手工法获取试剂和分析样本的半自动装置，它具有四个 检测通道，可以对四个标本同时测定，测定项目可任意设定。其特点 是把人为因素给固定化，如：把标本的预温和测定放在同一位置以避 免预温时间不等和从机外移动标本置检测部的过程中温度产生变化； 用LED灯和哨声来告知添加试剂的最佳时间；添加试剂时通过液面 感应器来启动摇匀器进行振动式自动混匀；倾斜式移液器架使试剂添加时沿管壁进入，防止气泡的产生。通过以上技术最大限度地避免了 人为影响因素，从而使半自动的仪器能够得到与全自动仪器毫不逊色的结果CA-7000 继承了 CA-6000 和CA-1500 的技术长处，成为目前CA系列中最先进的、功能最全的凝血分析仪。它能提供更快的检测 速度和更简单的操作方法，能够更多更准的对凝血和纤溶系统进行多 参数测定。本仪器具有目前世界上速度最快的处理能力， 对PT/APTT 进行同时测试时，检测速度可达500个测试/小时。除了保持MDA、 自动重检连锁功能、新的多规则质控检查法等一系列优势外， 为了能 够快速进行多项目同时测定，CA-7000使用了 3根取样针和5根试 剂针（包括用于乏因子血浆的一根针），提供3个机械手不断地传送 样品杯、及标本与试剂的混合。位于机械手之间的试剂针抓取装置是 为支持高速运行的需要新研制开发的。具作用是在放置3个试剂针的 针架上，选择和抓取相应的试剂针。吸完试剂后，该装置将试剂针送 回针架，然后抓取另一试剂针，这是一个快速重复的过程。位于针架 上已吸有试剂的针对试剂进行加热，到预定的时间后自动加入由机械 手直接运送到针架下的反应杯内。多根针的应用重叠了吸液和灌注的 时间，6秒钟即可完成试剂的灌注过程。另外，按相关的项目配置试 剂针，使为防止携带污染的洗针过程部分得以简化， 减少洗液的消耗， 提高检测速度。CA-7000能够同时用3种不同的原理进行分析。用 于发色底物法和免疫比浊法的光检测器装于反应杯抓取泵上，保证光测量时在摇晃的情况下由连续的光通过光路。 此种光检测器的每一通 道均有可移动的盖防止离散光进入。上述结构确保稳定和精确地测量 较弱的反应。可移动的试剂架消除一个接一个设置试剂容器的必要，并可以将试剂架从容器内取出直接放入冰箱内储存另外，这一条试剂架设置一种试剂，避免了因试剂用完造成的分析中断。 当测量时一 瓶试剂用完，CA-7000将自动取另一瓶试剂和按要求加入一瓶试剂 到试剂架空位上，避免检测停止。如果试剂全部消耗，仪器可能停止 相关项目的测定，继续分析其它的项目。对于这种情况，可在不中断 其它分析的条件下，将试剂架取出添加试剂。这样测定中断造成的时 间损失最小。另外，由于CA-7000的免开盖贯穿式进样针上装有静 电容量式感应器和样针撞击感应装置，使开放式试管和封闭式试管均 可混合使用。在软件方面，仪器可自动使用INR血浆绘制INR标准曲线，从而自动计算出 Local SI以及MNPT （Mean Normal Prothrombin Time: 正常人PT均值）。这可用于各实验室固有的 ISI和MNPT的设定，从而更方便了 PT的标准化。综上所述，从半自动的 CA-50到目前最先进的CA-7000 , CA 系列产品的阵容十分庞大，可以根据检测的标本数目和检验状况进行 选择和组合使用，并可对经常需要紧急处理的凝固 、纤溶检验进行 准确而迅速的多项处理，从而为提高检验效率和节省人力作出了很大 的贡献。正常时间