第二章愈伤组织组培

第第2 2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养第第2 2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养本章主要内容：本章主要内容：v愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化v愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养v愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 不定芽和根的发生不定芽和根的发生 体细胞胚的发生体细胞胚的发生v愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养l定义定义:是指将外植体是指将外植体(母体植株上的各个部分母体植株上的各个部分)接种到人工培养基上，在激素作用下，进行接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。愈伤组织培养愈伤组织培养(callus culture)第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化 一一 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导l诱导愈伤组织的关键主要是诱导愈伤组织的关键主要是培养条件培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。其中激素的成分和浓度是最重要的因素。第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养二愈伤组织的分化二愈伤组织的分化l从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：为三个时期：第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化愈伤组织分化愈伤组织分化诱导期诱导期分裂期分裂期分化期分化期Stage 1. Induction（诱导期）（诱导期）: 第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。诱导期细胞内发生的变化诱导期细胞内发生的变化气体交换增加，如氧气的吸收增加气体交换增加，如氧气的吸收增加RNA含量增加（增加到含量增加（增加到300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）酶活性增强酶活性增强第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化Stage 2. Cell division 分裂期分裂期 指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。增生子细胞的过程。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化1.1.细胞的细胞的数目迅速增加数目迅速增加；每个细胞；每个细胞平均鲜重下平均鲜重下降降。；。；细胞体积小，内无液泡细胞体积小，内无液泡。2 2细胞的核和核仁增大到最大。细胞的核和核仁增大到最大。3.3.细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不变含量保持不变。4. 4. 随着细胞不断分裂和生长，随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化分裂期细胞的主要表现分裂期细胞的主要表现:Stage 3. Differentiation 分化期分化期 指愈伤组织细胞停止分裂，指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上细胞内发生一系列形态和生理上的变化的变化, ,形成一些不同形态和功形成一些不同形态和功能的细胞的时期。能的细胞的时期。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化A A 细胞分裂部位和方向发生改变细胞分裂部位和方向发生改变：B B 形成瘤状或片状形成瘤状或片状的的分生组织结节分生组织结节。或。或维管组织结节。维管组织结节。C C 细胞的体积相对稳定，不再减少。细胞的体积相对稳定，不再减少。D D 出现了各种类型的细胞出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、：如管胞、纤维细胞、薄壁薄壁细胞、分生细胞、色素细胞细胞、分生细胞、色素细胞等。等。E E 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老老化的多转化为黄色或褐色化的多转化为黄色或褐色。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化分化期细胞特点：分化期细胞特点：第二节第二节 愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养1 1、定义定义：培养物在培养基上生长一段时间：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养培养基上培养, ,这个过程叫做这个过程叫做继代培养继代培养。第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养2、愈伤组织培养的调控因素：、愈伤组织培养的调控因素：外植体外植体培养基培养基培养环境培养环境第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（一）材料本身（一）材料本身第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养年龄年龄器官和部位器官和部位遗传型遗传型外植体外植体 1 1无机营养无机营养 l培养基中的培养基中的N N，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重要作用。要作用。l微量元素微量元素FeFe的用量较大的用量较大 2 2植物生长调节物质植物生长调节物质l一般使用的浓度为一般使用的浓度为0.1-10mg0.1-10mgL L。l使用植物生长调节剂时，要注意使用植物生长调节剂时，要注意种类和浓度种类和浓度，特别，特别是生长素和细胞分裂素的比值。是生长素和细胞分裂素的比值。 第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（二）培养基（二）培养基器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式激素配比模式)l生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向的控制条件，决定着发育的方向: :是愈伤组是愈伤组织、长根还是长芽。织、长根还是长芽。 高高 利于根的形成利于根的形成生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成 低低 利于芽的形成利于芽的形成第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养培养基中加入培养基中加入糖、各类糖、各类B B族维生素、肌醇和甘氨族维生素、肌醇和甘氨酸酸等，等，可满足愈伤组织生长和分化的要求可满足愈伤组织生长和分化的要求。各种各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进器官可促进器官分化。分化。水解酪蛋白水解酪蛋白中含有多种氨基酸，中含有多种氨基酸，助于器官分化助于器官分化酰胺类酰胺类往往有往往有促进器官形成促进器官形成的作用。的作用。第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养3有机成分有机成分第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养4.物理性质：物理性质：（1）固体培养、液体培养，对形态的）固体培养、液体培养，对形态的 发生有明显的作用。发生有明显的作用。（2）PH，一般是在，一般是在5.66.0之间，过高之间，过高过低对组培有不利的影响。过低对组培有不利的影响。（三）培养条件（三）培养条件第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养光照光照温度温度24-28光强、光照时间、光质光强、光照时间、光质（四）继代培养物的分化潜力（四）继代培养物的分化潜力l1、生理因素l在组织培养过程中，由于植物材料内部的一些生化变化，而导致继代培养物分化潜力发生的变化。l2、遗传因素l在继代培养中通常出现染色体紊乱，这是我们常称为苗变异，这与继代培养中分化能力丧失和倍性不稳定有关，在进行继代培养时，要尽量利用芽增殖或苗的途径。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生l形态建成形态建成：外植体细胞在适宜的培养条：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。小麦愈伤组织小麦愈伤组织第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养一、不定芽方式（一、不定芽方式（adventitious bud）l不定芽的发生，是愈伤组织培养物或细胞培养物中常见的器官发生方式，分为三个生长阶段：l1、是细胞和离体外植体脱分化形成愈伤组织，这是外植体发生细胞分裂的结果。l2、为愈伤组织中形成一些分生细胞，形成瘤状结构，这是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的共同结果。l3、器官原基的形成，从而分化出芽和根。外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(2,4-D)低低(细胞分裂素细胞分裂素/生长素生长素)高高(细胞分裂素细胞分裂素/生长素生长素)一、不定芽方式（一、不定芽方式（adventitious bud）第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；即无根的芽或无芽的根；（2）先长芽，后长根，）先长芽，后长根，多数情况多数情况；（3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生胚状体（胚状体（embryoid）：）：指在组织培养中指在组织培养中，由，由一个非合子细胞一个非合子细胞( (体细胞体细胞) )，经胚胎发生和胚，经胚胎发生和胚胎发育过程胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚鱼雷胚和子叶胚5 5个时期），个时期），形成具有双极形成具有双极性的胚状结构。性的胚状结构。合子胚：通常将高等植物的卵细胞在受精后所合子胚：通常将高等植物的卵细胞在受精后所发育成的胚称为合子胚。发育成的胚称为合子胚。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生二、体细胞胚的发生二、体细胞胚的发生胚状体与合子胚的比较胚状体与合子胚的比较:合子胚合子胚胚状体胚状体质量质量萌发率高，质量好萌发率高，质量好萌发率低，质量差萌发率低，质量差来源来源受精卵受精卵体细胞体细胞胚柄胚柄有，明显有，明显即使有也不明显即使有也不明显形态形态固定，体积相对较小固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子复杂，常有两个以上的子叶，体积较大叶，体积较大变异率变异率低低高高第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:l胚状体胚状体具有两极性具有两极性，即有茎端和根端。，即有茎端和根端。l胚状体的胚状体的维管组织与外植体的维管组织维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系无解剖结构上的联系。l胚状体胚状体维管组织的分布是独立的维管组织的分布是独立的“Y”Y”字形字形。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：l胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体产生的数量比不定芽多；l胚状体可以制成人工种子，便于运输和胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存保存；l胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用1 1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；2 2、培育无病毒苗木；、培育无病毒苗木；3 3、获得倍性不同的植株；、获得倍性不同的植株；4 4、克服远缘杂交困难；、克服远缘杂交困难；5 5、利于种质资源长期保存和远距离运输；、利于种质资源长期保存和远距离运输；6 6、提供育种中间材料；、提供育种中间材料；7 7、诱发和离体筛选突变体；、诱发和离体筛选突变体；8 8、制造人工种子。、制造人工种子。第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用