细胞生物学之细胞凋亡及其调控的分子机制

细胞凋亡及其调控的分子机制 细胞凋亡的基本概念 : 细胞凋亡 （ apoptosis)(有树叶凋零之意 ) 或 程序化细胞死亡 （ programmed cell death , PCD) 是指多细胞有机体在正常生理或病理情 况下，发生的一种由多基因控制的主动死亡 过程。 第一节 凋亡细胞的特征及生物学意义 (一 ) 细胞凋亡的组织学变化 只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好； 与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起 炎症反应 (二 ) 主要形态学特征 (多阶段 ) 凋亡细胞其形态特征表现为细胞皱缩、变小； 核固缩，胞质浓缩，细胞急剧变小； 细胞骨架解体，最后变成若干个凋亡小体。 注意点： 凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容 物不释放，不引起炎症反应。 一、细胞凋亡的基本特征 1. 细胞核的变化 核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边 缘呈多种形状排列，然后逐步分裂为碎片（核碎片 形成）。 2. 细胞质的变化 (1) 胞质脱水浓缩，体积减少约 30% (2 ) 细胞器的变化 : A.线粒体早期体积增大，嵴增多 晚期成空泡状 , B失去微绒毛、细胞突起及细胞表 面皱褶，膜电位下降，膜 流动性下降； C. 内质网 腔扩大； D. 细胞骨架变得致密和紊乱。 3. 凋亡小体的形成 * 凋亡小体的概念 指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等， 含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。 * 形成机制 （ 1）细胞表面突起形成 -包裹膜融合、根部缩 窄 脱落 （ 2）胞内自噬体形成 -向胞外释放 应指出！有时凋亡细胞膜不分割，仅发生核固缩和 胞质高度浓缩成单个致密结构亦称凋亡小体。 凋亡时细胞的形态学改变 空泡化 固缩 出芽 边集 凋亡小体 (二 ) 细胞凋亡的生化特征 1. DNA片段化（主） 凋亡细胞 DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征性 梯状条带图谱（ Ladder）。 机制： 核小体中的组蛋白与 DNA的连结键断 裂，内源性核酸内切酶被激活，有控制的特 异地将 DNA降解为 180200bp整数倍大小 的若干条带。 DNA Fragmentation Nucleosomal Banding Pattern 3. 其它生化改变 1) 胞浆 Ca2+水平 与细胞凋亡的关系密切，实验证明，凋亡的发生伴 随胞浆 Ca的升高。 2) 胞浆 H离子浓度 细胞凋亡伴随胞浆 PH下降。 3) 线粒体 凋亡时，呼吸链受损， ATP合成下降，膜电位下降 (m) ；膜通透性增加。 4) 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 膜磷脂的不对称性分布改变 , 凋亡时 PS由质膜内 侧翻向外侧 . （二）细胞凋亡与坏死的区别 -1 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 细胞数量 膜完整性 染色质 细胞核 细胞器 胞内容物 生理性、弱刺激性 单个细胞丢失 保持至晚 凝聚呈半月状 早期固缩、断裂 无明显变化 无释放 强烈刺激 成群细胞死亡 早期即丧失 稀疏呈网状 晚期破碎 肿胀、破坏 释放 细胞凋亡 细胞坏死 细胞形状 基因组 DNA 大分子合成 基因调控 后果 意义 形成凋亡小体 受调控降解 一般需要 有 不引起炎症反应 生理性死亡 破裂成碎片 随机降解 不需要 无 引起炎症反应 病理性死亡 细胞凋亡与坏死的区别 -2 二、细胞凋亡的广泛性及其意义 作为一种生理性细胞消亡方式，普遍存 在生物界；例如： 1 高等脊椎动物胚胎发育中某些细胞的丢失 ; 2 两栖类动物变态过程中幼体器官的退化 ; 3 成熟个体中亦有细胞凋亡发生，如：血细胞、上皮 细胞、肝细胞等以正常细胞更新衰老细胞过程； 4 通过凋亡清除受损伤或癌前病变的细胞 ,防止癌变 ; 5 病毒、药物、毒物等均能诱发细胞凋亡。 细胞凋亡的生物学意义 其一 : 具有清除个体发育过程及成熟个体中多 余细胞及老化细胞的机体调节作用 其二 : 具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒 感染细胞的机体防御作用 因此， 细胞凋亡是维持个体生存所必需的 一种生物学机制 细胞凋亡的发生机制 一、细胞凋亡的酶学基础 细胞内一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋 亡过程的核心事件。 有人甚至认为细胞凋亡过程就是蛋白酶级 联反应的过程。 （一） caspase家族与细胞凋亡 Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶 (Cysteinyl aspartate-specific protease); 是一类与白介素 -1 转化酶和线虫凋亡基因 Ced (ICE/Ced)同源的一类半胱氨酸蛋白酶 ; 活性位点含有保守的 aa序列 (QACXG, X为 R,Q或 G); 以无活性的酶原形式合成并存在于细胞中； 可以被上游 Caspase或自身切割保守的 ASP 活化； 1. Caspase的性质和种类 已在哺乳类中发现 14种，分为 3个亚类： Caspase-1亚家族， Caspase-2亚家族， Caspase-3亚家族 亦可根据前体分子 (procaspase)N端的原结 构域 (prodomain)分为 2类 : 具” Long-prodomain”的启始分子 (initiator), 如 -8、 -9、 -10等，为蛋白酶级联反应的启始者， 其活化后再切割和活化下游 Caspase； 具” short-prodomain”的效应分子 (effector), 如 -3、 -6、 -7等，作为上游酶的底物被切割活化， 再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。 2. Caspase的结构特点和活化机制 原结构域 大亚基 小亚基 N端 D28 QACRG D175 IETD Caspase 异二聚体化 异四聚体化 蛋白酶活性 3. Caspase活化的级联反应过程 多种凋亡因素，通过多种途径活化 Caspase; 凋亡时 起始 Caspase首先被活化 ,其后又切割 并活化下游 Caspase,级联放大 ,直至 效应 Caspase被活化； 细胞中的 Caspase一旦被活化 ,凋亡即不可避 免 ; 4. 效应 caspase引起细胞凋亡的机制 已发现的 caspase底物上百种 , 仅少数底物与凋 亡的关系被确认 ; 灭活细胞内凋亡抑制蛋白 非凋亡细胞中 , CDA (caspase活化的 DNAase)与其抑制 蛋白 (ICDA)结合 ; 凋亡细胞中 , caspase剪切 ICDA; CDA游离并进入核内降解 DNA,细胞凋亡 . 剪切细胞结构蛋白 如 Caspase对核板的降解作用 ; 在凋亡过程中 , caspase在单一位点剪切核纤层蛋白 (lamin), 导致核板塌陷 , 染色质浓缩 . 剪切效应蛋白 : 如参与基因表达蛋白因子 ,如 PARP 活化 caspase抑制剂 (二 ) 介导细胞凋亡的其他酶类 核酸内切酶 (endonuclease) 主要是 DNase, 包括 DNase 、 DNase 、 NUC18等； 大多数 DNase在细胞凋亡时作为 caspase的底物被活化 并发挥作用，如 CAD等； 其作用点是核小体的连接处切割 DNA，产生 180200bp 的 Ladder. 蛋白激酶 (protein kinase， PK) PKC可通过 caspase相互作用影响细胞凋亡； DNA-PK（ DNA依赖性蛋白激酶），活化后参与 DNA损 伤与修复，能抑制凋亡， 能被 caspase-3灭活。 其他酶类： 丝氨酸蛋白酶（如粒酶 B）、 calpain、 NOS等 二、细胞凋亡的信号传递途径 细胞凋亡的影响信号分为 2类： 一类为凋亡的负调控信号（抑制凋亡）； 另类为凋亡的正调控信号（诱导凋亡） 细胞凋亡信号转导通路的特点： 同一性： 各种因素引起的凋亡的形态与生化改 变均相同。 多样性： 环境因素不同，细胞类型不同，或刺 激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生， 其信号传递途径是不同的。 分类： 百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成 一条条的信息传导通路，可分为 基本传导通路 和非专一性传导通路二类。 （一）死亡受体介导的细胞凋亡 死亡受体 (death receptors,DR)： 指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子， 并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体。 属肿瘤坏死因子受体（ TNF）超家族； 包括 16个富 Cys结构域组成的保守的胞外区， 和一个由 6080aa组成的 “ 死亡结构域 ” (death domain, DD)； DD将受体信号与胞内凋亡机制相偶联； 分类： CD95(Fas/Apol), TNFR1,TNFR2, DR3(Apol3/Esl1)等近十种。 死亡结构域 ” 概念： 是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导 细胞凋亡所必需的一段高度同源的 aa序列。 种类： FADD： fas-associated death domain (Fas相关的 死亡结构域 )； TRADD： TNF recptor-associated death domain (TNF1受体相关的死亡结构域 )； RIP： receptor interacting protein (受体相互作用 蛋白 )（含相似的死亡域） DD的活化或过表达都会导致细胞凋亡 . TNF TNF TNF DD DD DD TNFR1 DD DD 死 亡 诱 导 信 号 复 合 物 (DISC ) 形 成 DD RIP DD FADD DED 活化 NF-B， AP-1 促进炎症， 免疫反应等 活化 Caspase-8 Caspase级联放大 细胞凋亡 TRADD （二）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径 线粒体细胞凋亡过程中既是引发器，又是信号放大 器； 几乎所有的诱导剂引起的细胞凋亡都伴随着线粒体 跨膜电位 (m)的下降 ; m的维持，与线粒体膜通透性转运孔（ MPT）部 分相关； 几乎所有的凋亡诱导因素导致 MPT破坏或开放； 开放的后果是， m 下降、氧化磷化脱偶联、 GSH耗竭、 ROS产生等，并形成恶习性循环。 MPT的这种自我放大效应，很可能是一种细胞死亡 “ 全或无 ” 的开关。 线粒体释放的凋亡诱导分子 在多种诱导因子（如 Bax过表达、 UV照射）作 用下， MPT开放和 外膜破坏； 线粒体释放多种凋亡相关分子，如 CytC、 Smac、 Endo G等 细胞色素 C： 释放到胞质中的 CytC，可特异性地结合接头蛋 白 Apaf并使之寡聚化， Apaf借助 N-端 caspase 相关征蓦结构域 （ CARD） ,直接蓦集多个 caspase-9并使之活 - -凋亡。 （三）细胞核凋亡诱导途径（略） 细胞毒 T淋巴细胞杀伤靶细胞的机制之一， 就是通过粒酶 B来实现的。 粒酶 B的特点 粒酶（ cranzyme, Cr）是 CTL和 NK细胞杀 伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称； 首先酶原形式合成，受刺激后激活； 已发现 5种： CrA、 B， H、 M和类胰蛋白 酶 -2; 其中以 CrB促凋亡作用最强 ; （三）粒酶 B介导的细胞凋亡 粒酶 B诱导细胞凋亡的途径 CrB由 CTL分泌进入靶细胞胞浆后 ,其丝氨酸蛋白 酶在胞浆 pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆 和核中的多种底物； 以此介导的死亡途径是多层次、多水平的，以便 快速清除异常细胞 ； Caspase依赖的死亡通路是 CrB介导细胞死亡的 重要途径之一： 在体外， pro-Caspase家族中，除 -1外其余的都 可被 CrB切割活化， -10和 -7是 CrB的最适底物； 线粒体介导的死亡途径是另一个重要的途径： 需要多种蛋白质（如 Bax、 Bid、 Bak）参与，与 线粒体膜通透性及 m 有关。 死亡受体 (Fas/CD95,TNFR1) CD95配体 ,TNF- FADD Caspase-8,10 Caspase-3,6,7 PARP,Lamin,PK,DNA-PK DNA断裂 ,细胞固缩等 细胞凋亡 Caspase 激活物 起始 Caspase 效应 Caspase Caspase 底物 CTL 粒酶 B,穿孔素 胞外 CrB 生长因子撤除 , 化学药物等 Cyt C Apaf-1 Caspase-9 AIF,endo G 凋亡主要途径小结 第三节 细胞凋亡的调控 目前普遍认为，细胞凋亡与细胞分裂、分 化类似，受细胞内多种基因的调控，是一 个级联式基因表达的结果。 已发现许多基因参与细胞凋亡的基因调控， 包括： ced、 bcl-2 、 ICE、 p53、 IAP家族、 Fas/Apo、 c-myc等。 至今调控机理尚未十分明了。 P53的结构： p53基因位于人染色体的 17 p13.17，编码 53kDa的 P53蛋白转录因子； 野生型 P53蛋白由 393aa组成，活性形式为四 聚体； 自 N端起包括：转录活化区、 DNA结合区、 四聚体化区和 C-调节区； C-端的 26aa构成一个开放的结构域，易被降 解或磷酸化修饰，受其他蛋白调节。 一、细胞自身蛋白的调控作用 （一） P53蛋白的调控作用 P53的表达与活性调节 正常状态下： 胞浆 P53水平很低，半衰期很短， 胞内 P53被严格监控，受 HDM2的负反馈调节， 并通过泛素降解途径调节 P53水平。 异常情况下： 当细胞 DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常 表达等细胞生存面临威胁时； P53水平迅速升高和活化； P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用 野生型 P53蛋白： 具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用； P53蛋白作为 “ 基因警卫 ” 负责维持基因组的完 整性、 DNA损伤修复和细胞周期的正常运转； 如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡 的基因表达，使细胞进入凋亡状态。 突变型 P53蛋白： 丧失抑制细胞恶性增殖功能， p53基因突变是 50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因 ; 并且本身具有癌基因功能。 P53蛋白 基因卫士 P53蛋白 解链酶 复制因子 A P21蛋白 细胞停滞于 G1期 细胞凋亡 酸性区 核心区 碱性区 P53蛋白 DNA损伤 P21基因 P53蛋白 抑 制 P53蛋白 细 胞 周 期 (二 )Bcl-2基因家族 bcl-2基因 bcl-2基因发现于 1985年。定位于 18q21 基因长约 230kb（ 2个内含子各 3 个外显子），编码 23kd膜 镶嵌蛋白质，与 Ced-9有 23%的同源性。 Bcl-2对需要长期生存的细胞 ,如神经细胞、免疫记 忆细胞和造血祖细胞等的寿命有重要意义。 急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性粒 细胞白血病，细胞膜内 Bcl-2蛋白质增加显著。 Bcl-2的功能 属 凋亡抑制基因 ，阻遏细胞凋亡，延长细 胞寿命，但对细胞周期和分化无影响 阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如 Bcl-2能阻止由 r射线和多种化疗药导致的细 胞凋亡。 Bcl-2蛋白具抗氧化作用 Bcl-2蛋白抑制细胞器内 Ca2+ 离子向胞质释 放，而凋亡必须有 Ca2+ 离子参与 。 bcl-2家族 家族成员 可能存在的聚合体形式 抑 制 凋 亡 促 进 凋 亡 bcl-2 Bcl-2/Bcl-2 Bax/Bcl-2 bcl-xL Bcl-xL/bcl-xL Bcl-2/Bcl-xL bax Bax/Bax Bax/Bcl-2 bad Bad/Bcl-2 Bad/Bcl-xL bcl-xs Bcl-xs/Bcl-2 Bcl-xs/Bcl-xL Mcl-1 Mcl-1/bcl-xL Mcl-1/Bcl-2 Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制 Bcl-2、 Bax和 Bcl-x组成一个凋亡调控系统 当 Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞 凋亡； 随 bcl-2表达量增加，渐多的 Bax/Bax解聚， 形成更稳定的 Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中 和了 Bax/Bax诱导凋亡的作用。即 Bax和 Bcl-2 比值调节凋亡 ； 当 Bcl-xs存在时，优先形成 Bcl-xs/Bcl-2 ， 使 Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。 第四节 检测细胞凋亡的常用技术 一、凋亡的形态学检查（光镜、电镜） 1 苏木素 伊红（ HE）染色法 : 应用范围： 石蜡组织切片、细胞涂片 结果判断： 正常细胞保持原生长形状，梭形或多角形；细胞核 呈蓝黑色，胞浆呈淡黄色。 凋亡细胞表现为核染色致密浓缩、核碎裂；凋亡细 胞涂片可见凋亡小体。 坏死细胞呈均质红染，无结构、核染色消失。 2. 甲基绿 派诺宁染色法 : 3. Giemsa 染色法 : 4. 瑞氏 (Wright)染色法 5. 透射电子显微镜观察法 二、荧光显微镜观察法 吖啶橙染色法、 Hoechst染色法 Hoechst 染色法 （一）琼脂糖凝胶电泳法 基本操作步骤： 染色体组 DNA提取 11.5%琼脂糖电泳 (含 EB) 电泳后于紫外灯下观察并照相留底 有无 200bp左右的 ladder出现作为判断细胞 凋亡 亦可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 三、凋亡细胞的生化特征的检测 (二 ) 原位末端标记技术 (in situ end lableing, ISEL) 原理 : ISEL的原理是基于细胞凋亡时， DNA断裂，利 用末端脱氧核苷酸转移酶（ TdT）或 DNA聚合酶将 带有生物素标记的核苷酸（ biotin-16-dUTP）掺入 到断裂的 DNA的 3端，再使其与带有辣根过氧化物 酶的抗生物蛋白结合，经 DAB显色后，便可观察到 细胞内是否存在 DNA片段端存在。 主要方法有 2种 : 1. TdT介导的 dUTP缺口末端标记 (TUNEL) 2. DNA聚合酶 I 或 klenow大片段介导的原位的缺口平 移 (ISNT) 该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞 . 四、凋亡细胞的流式细胞术检测 基本操作步骤 : 离心收集细胞 -重悬于 70%乙醇 ,-20 固定 24小时 -离心后重悬细胞 PBS缓冲液 -加 PI （碘化丙啶）染色 (含 RNaseA), 37 保温 30min-流式细胞术分析 亦可用 PI/Hoechst双染 . 通过亚二倍体峰的的有无及面积积分来评断 细胞凋亡 . 第六节 细胞凋亡与临床疾病 机体的生存取决于机体是否于平衡状态， 而最重要的平衡是细胞数量的平衡，这种平衡 又取决于细胞增殖与细胞凋亡（及坏死）。 细胞凋亡是多细胞生物体内一个重要的生 命现象，既可发生在个体发育过程和成体正常 生理过程；亦可发生疾病发生发展过程。 细胞凋亡的失调与许多疾病密切相关，包 括肿瘤、神经变性、自身免疫、心脏疾病等。 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡减少有关 细胞凋亡增加有关 1. 癌症 : 淋巴癌 P53突变所致癌 依赖于激素引起的癌 2. 自身免疫性疾病 红斑浓疮 免疫介导的肾小管肾炎 3. 病毒感染 疱疹病毒 腺病毒 痘病毒 1. AIDS 2. 神经退行性病变 帕金森病 老年痴呆 3. 再生性障碍贫血 4. 缺血性损伤 心肌梗塞 脑卒中 再灌注损伤 5. 酒精肝 一、细胞凋亡自身免疫性疾病 正常情况下： 90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡， 那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被 选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生 免疫应答； 如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋 巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞， 导致发生自身免疫性疾病。 发病的分子机制： 淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表 面受体 Fas（又称 APO或 CD95）， Fas受体与 FasL （配体）结合即可激活凋亡信号传导途径， 细胞凋亡； T细胞表面受体 Fas和 FasL发生突变时， T细胞不 能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。 除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自 身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性 改变（ Fas和 FasL突变）有关。 二、细胞凋亡病毒性疾病 现已证明，病毒的溶解性感染所产生的细胞病 变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感 染与病毒抑制细胞凋亡有关。 病毒感染引发细胞凋亡： 牛疱疹病毒、鸡白血病毒 和 HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞 缺失。如 HIV感染后引起 CD4+T细胞凋亡而缺失。 病毒感染抑制细胞凋亡： 许多病毒具有抑制细胞凋 亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时 间、以最大限度产生子代病毒。如 EB病毒产生 LMP-1，使 Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生 crmA, 可抑制由 caspase所介导的细胞凋亡。 三、细胞凋亡与肿瘤 现已证明，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾 病，同时也是细胞凋亡异常疾病。 大多数肿瘤 P53突变、而有些肿瘤过度表达 Bcl-2 蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。 P53蛋白作为 “ 基因警卫 ” 负责维持基因组的完整 性、 DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损 伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达， 使细胞进入凋亡状态。 Bcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞 寿命。