常见病原微生物的检测

第六章 常见病原微生物的检测禽流感病毒布鲁氏杆菌疯牛病病毒炭疽杆菌 第一节 禽流感病毒n禽流感是禽流行性感冒（AvianInfluenza，AI）的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。 n一、生物学特性 n 1、形态学特点n禽流感病毒是正粘病毒，流感病毒属的一个成员。n禽流感病毒具有A型抗原,属于A型流感病毒,列为禽流感病毒类。本病毒颗粒呈球形、杆状或长丝状,为多形性。其直径为80120nm,表面有一层棒状和蘑菇状的纤突，有囊膜,囊膜下面有一层膜蛋白,紧紧地包裹着呈螺旋状对称的核衣壳。 n 2、禽流感病毒的分型n流感病毒分为三个不同的抗原型,即A、B、C三型。其中B、C两型仅能对人致病,A型可对人、猪、马和禽致病。n依据病毒表面的两种糖蛋白血凝素HA和神经氨酸酶NA可将A型流感病毒分成若干亚型。目前已有15种HA和9种NA。 n 3、抵抗力n对热的抵抗力较低，60 10分钟，70 2分钟即可致弱，普通消毒剂能很快将它杀死。n低温冻干或甘油保存可使病毒存活多年。 n 4、流行病学n禽流感在家禽中以鸡和火鸡及某些野禽的易感性最高，并呈急性致死性传染病。n鸭、鹅及其它水禽类的易感性较差，多为隐性感染或带毒，有时也能大批死亡。鸽子可带毒，但很少自然发病。 n 5、临床症状和病理变化n禽流感的症状极为复杂.根据禽类的种类鸡、火鸡、鸭、鹅及野鸟等以及病毒的亚型类别的不同，表现各种各样的变化：有最急性、急性、亚急性及隐性感染等。n潜伏期一般较短，通常为45天，体温急剧上升至43.344.4.c，精神沉郁、拒食、病鸡很快陷于昏睡状态，有些颈部出现向后扭转的神经症状。病鸡多呈急性死亡，有的也可能出现呼吸道症状，咳嗽、打喷嚏，气管出现咯音，流泪等症状，羽毛蓬松，产蛋率下降，死亡率高低不等。 n二、诊断 1、病原的分离n病原的分离和鉴定可以从活体或尸体分离病毒。n用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒，可用不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，然后将拭子放入灭菌的保存液2550%甘油盐水、肉汤或1000u/ml青霉素和10mg/mL链霉素的细胞维持液中。n病料的采取时间很重要,一般在感染初期或发病急性期采取。如转为后期则因机体已形成足够的抗体而不易分离到病毒. n 2、病毒分离n通常用鸡胚来进行。n接种910日龄鸡胚尿囊腔，继续孵育4872h。n如材料中含有病毒时，则接种48h鸡胚死亡，但在多数情况下初代分离时鸡胚多不死，为此需将经72h未死的鸡胚置冰箱内冻死后，收集尿囊液作第二代接种。如第二代接种的鸡胚仍不死亡，即可判定分离病毒为阴性。 三、介绍高致病性禽流感的其他知识n鉴定高致病性禽流感的标准: 最近国际上评价禽流感病毒致病力的经典方法是接种易感鸡。按照国际标准，能引起接种鸡死亡75以上的分离株，是高致病性毒株。尽管接种鸡是确定致病的“黄金标准”，但它不能反应致死率小于75%的H5或H7亚型病毒的潜在致病力。因此0IE(国际兽疫局根据科学家的建议,推出新鉴定标准。 1 任何分离到A型流感病毒，用0.2mL1:10稀释的无菌尿囊液静脉或肌肉注射8只48周龄易感鸡,10天内的死亡率不低于75%。 2.对所有低致病的H5、H7毒株,血凝素切割位点的氨基酸序列与高致病性禽流感病毒一致。 3.H5、H7以外的A型流感病毒,可以致死15只鸡,在缺乏胰蛋白酶的情况下,能在细胞上生长形成蚀斑。 禽流感的传播途径是什么？n禽流感的传播有病禽和健康禽直接接触和病毒污染物间接接触两种。n禽流感病毒存在于病禽和感染禽的消化道、呼吸道和禽体脏器组织中。因此病毒可随眼、鼻、口腔分泌物及粪便排出体外，含禽病毒的分泌物、粪便、死禽尸体污染的任何物体，如饲料、饮水、鸡舍、空气、笼具、饲养管理用具，运输车辆、昆虫以及各种携带病毒的鸟类等均可机械性传播。健康禽通过呼吸道和消化道感染，引起发病。 如何防范禽流感 n禽流感被国际兽疫局定为类传染病，且变异后的病毒能威胁人类健康，但各国专家们说，及时、适当的预防措施可以使人类避免感染。 n 1、避免直接接触病禽及其排泄物、分泌物等能有效防止感染病毒。 n 2、饲养员、屠宰工人等经常与活禽密切接触的人，必须做好保护工作，包括穿防护服、佩戴防护用具、及时接种流感疫苗、工作前后彻底消毒等。 n 3、注重自身健康、保持良好的免疫力也是避免感染禽流感病毒的有效措施。n 4、不要去疫区旅游。n 5、食用烹熟的家禽肉、蛋不会传染禽流感。 禽流感与其他流感有什么关系？n除禽流感以外，常见的流感还有人流感、马流感和猪流感等。禽流感与人流感和人类健康的关系非常密切。由于猪与人的种间差异较小，禽流感病毒可以在中间宿主(猪)体内与人流感病毒杂交，并产生能感染人的新的流感病毒。 禽流感病毒为何消灭不了？n流感病毒为了生存而不断发生变异，以逃脱动物产生的特异性抵抗力。人们为了预防禽流感也研制出了各种疫苗。但机体在产生特异性抗体后，病毒为逃脱机体的扑杀而不断地发生着变异，这样原有的抗体即失去作用，病毒就可使动物重新发病。因此就目前的防疫技术和手段而言，禽流感病毒是消灭不了的。 第二节 疯牛病病毒 一、 认识疯牛病n牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy, BSE），又称疯牛病，是一种侵犯牛中枢神经系统的慢性的致命性疾病，由一种非常规的病毒朊病毒（Prion）引起的一种亚急性海绵状脑病，这类病还包括绵羊的搔痒病、人的克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD） （又称早老痴呆症） 、库鲁病以及最近发现的致死性家庭性失眠症等等。 n 共同特征是：生物体的认知和运动功能严重衰退直至死亡。其中人的克-雅氏病是一种罕见的主要发生在50-70岁的可传播的脑病，产生的危害极大。 二、认识朊病毒n朊病毒是一类非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一种不含核酸仅有蛋白质的蛋白感染因子。 n对蛋白酶具有抗性，易溶于去污剂、有致病力和不诱发抗体等特性 ；n朊病毒颗粒耐高温，即使加热到360仍有感染力，植物油的沸点（160一170）也不足以灭活，耐甲醛、强碱；朊病毒颗粒对一些理化因素的抵抗力之强，大大高于已知的各类微生物和寄生虫，其传染性强、危害性大的特性极不利于人类和动物的健康。n法国专家发现，导致疯牛病等疾病的朊病毒从一类动物传染给另一类动物后，即这种病毒跨物种传播后，其毒性更强，潜伏期更短。 n三、症状临床表现为脑组织的海绵体化、空泡化，星形胶质细胞和微小胶质细胞的形成以及致病型蛋白积累，无免疫反应。病原体通过血液进入人的大脑，将人的脑组织变成海绵状，如同糨糊，完全失去功能。受感染的人会出现睡眠紊乱、失语症、肌肉萎缩和进行性痴呆等症状，并且会在发病的一年内死亡。该病有常染色体家族遗传倾向，并且有一个新的克雅氏病的报道（该病与牛海绵状脑病有潜在的联系）。此病的病理学特征包括以小脑和大脑皮层为主的海绵样变性和朊病毒的出现。 n四、疯牛病的传染与防治牛的感染过程通常是：被疯牛病病原体感染的肉和骨髓制成的饲料被牛食用后，经胃肠消化吸收，经过血液到大脑，破坏大脑，使失去功能呈海绵状，导致疯牛病。 n人类感染通常是因为下面几个因素：1、食用感染了疯牛病的牛肉及其制品也会导致感染，特别是从脊椎剔下的肉（一般德国牛肉香肠都是用这种肉制成）；2、某些化妆品除了使用植物原料之外，也有使用动物原料的成分，所以化妆品也有可能含有疯牛病病毒（化妆品所使用的牛羊器官或组织成分有：胎盘素、羊水、胶原蛋白、脑糖）；3、而有一些科学家认为“疯牛病”在人类变异成“克-雅氏病”的病因，不是因为吃了感染疯牛病的牛肉，而是环境污染直接造成的。认为环境中超标的金属锰含量可能是“疯牛病”和“克-雅氏病”的病因。 第三节 布鲁氏杆菌n一、生物学性状n1、形态染色n本菌属初次分离培养时多呈小球杆状，毒力菌株有荚膜，经传代培养渐呈杆状，革兰氏染色阴性。 n 2、培养特性n本菌为严格需氧菌。n牛布氏杆菌在初次分离时，需在510%CO2环境中才能生长，最适温度37，最适的pH6.67.1,营养要求高，生长时需硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙等，实验室常用肝浸液培养基或改良厚氏培养基。n此菌生缓慢，培养48小时后才出现透明的小菌落，鸡胚培养也能生长。n n 3、抵抗力n在自然界中抵抗力较强，在病畜的脏器和分泌物中，一般能存活4个月左右，在食品中约能生存2个月。对低温的抵抗力也强，对热和消毒剂抵抗力弱。对链霉素、氯霉素和四环素等均敏感。n n二、致病性和免疫性n本菌侵入人体后，被吞噬细胞吞噬，由于本菌具有荚膜，能抵抗吞噬细胞的吞噬消毁，并能在该细胞内增殖。反复出现菌血症。由于内毒素的作用，病人出现发热、无力等中毒症状，血流中细菌逐步消失，体温也逐渐消退。细菌在细胞内繁殖至一定程度时，再次进入血流又出现菌血症，体温再次上升，反复呈波浪热型。n本菌多为细胞内寄生，治疗难于彻底，易转为慢性及反复发作，在全身各处引起迁徒性病变。 三、主要症状n人感染布氏杆菌较家畜严重，病情复杂，表现乏力，全身软弱，食欲不振，失眠，咳嗽，有白色痰，可听到肺部干鸣，多呈波浪热，也有稽留热、不规则热或不发热。盗汗或大汗，一个或多个关节发生无红肿热的疼痛，肌肉酸痛，应用一般镇痛药不能缓解，由于关节和肌肉疼痛难忍，即使不发烧也不能劳动，成为能吃不能活懒汉，故该病又被称作懒汉病。病灶发生在生殖器官，影响生育，严重者可引起死亡。 n家畜患病没有治疗价值。应全部淘汰，消灭传染源。 四、微生物学检验n本菌传染性大，要注意防止实验室污染。n（一）分离培养n急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接种于双相肝浸液培养基（一半斜面，一半液体）置37n 10%CO2环境中培养，每隔2天检查一次，如无细菌生长则摇荡培养基，使液体浸过斜面上，有细菌生长，可依鉴定项目确定是否为布氏杆菌。经一月培养无细菌生长，可报告阴性。 n n（二）血清学检查n通常作凝集试验，判定凝集效价1：50可疑，1：100以上为阳性。效价增高4倍以上时，更有诊断价值。 第四节炭疽杆菌n炭疽杆菌（Bacillus anthraci）属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不能放松警惕。 n一、生物学性状n（一）形态染色n炭疽杆菌菌体粗大。排列似竹节状，无鞭毛，无动力，革兰氏染色阳性，本菌在氧气充足，温度适宜（2530）的条件下易形成芽胞。n在活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。形成荚膜是毒性特征。n炭疽杆菌受低浓度青霉素作用，菌体可肿大形成园珠，称为“串珠反应”。这也是炭疽杆菌特有的反应。 n（二）培养特性n 1、本菌专性需氧，在普通培养基中易繁殖。n 2、最适温度为37，最适pH为7.27.4n 3、在琼脂平板培养24小时,粗糙菌落。菌落呈毛玻璃状，边缘不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，这是本菌向外伸延繁殖所致n 4、在510%绵羊血液琼脂平板上，菌落周围无明显的溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血。菌落有粘性，用接种针钩取可拉成丝，称为“拉丝”现象。n 5、在普通肉汤培养1824小时，管底有絮状沉淀生长，无菌膜，菌液清亮。有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。 n（三）抵抗力n繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力强，在干燥的室温环境中可存活数十年，在皮毛中可存活数年。牧场一旦被污染，芽胞可存活数年至数十年。煮沸10分钟或干热140 3小时可将芽胞杀死。炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、先锋霉素、链霉素、卡那霉素等高度敏感。 二、致病性与免疫性n（一）致病性n人类主要通过工农业生产而感染。机体抵抗力降低时，接触污染物品可发生下列疾病：n 1皮肤炭疽 最常见，多发生于屠宰、制革或毛刷工人及饲养员。本菌由体表破损处进入体内，开始在入侵处形成水疖、水疱、脓疱、中央部呈黑色坏死，周围有浸润水肿、如不及时治疗，细菌可进一步侵入局部淋巴结或侵入血流，引起败血症死亡。 n 2纵隔障炭疽 少见，由吸入病菌芽胞所致，多发生于皮毛工人，病死率高。病初似感冒，进而出现严重的支气管肺炎，可在23天内死于中毒性休克。n 3肠炭疽 由食入病兽肉制品所致，以全身中毒症状为主，并有胃肠道溃疡、出血及毒血症，发病后23日内死亡。n上述疾病若引起败血症时，可继发“炭疽性脑膜炎”。炭疽杆菌的致病性取决于荚膜和毒素的协同作用。 n（二）免疫性n注射炭疽外毒素中保护性抗原于机体，能形成抗毒素免疫，对受染咴疽有保护作用。但单纯的荚膜抗体对机体没有保护作用。病后可获较强的免疫力。 三、微生物学检查n采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，吸入性炭疽的咯痰，肠炭疽的粪便以及病人的的血液等送检，兽尸禁止解剖，可割取耳朵或舌尖一片送检。n将标本直接涂片，沙黄荚膜染色镜检，观察形态及荚膜特征，可以初步帮助诊断，确诊应进行血平板分离培养，37孵育1215小时，钩取可疑菌落，进行青霉素串珠试验，噬菌体裂解试验，碳酸氢钠平板二氧化碳培养。荚膜肿胀试验和小白鼠致病力试验等与其他需氧芽胞杆菌进行鉴别确定。 四、特异防治n预防人类炭疽首先应防止家畜炭疽的发生。家畜炭疽感染消灭后，人类的传染源也随之消灭。n目前我国使用的炭疽活疫菌，作皮上划痕接种，免疫力可维护半年至一年。青霉素是治疗炭疽的首选药物，对肠道及吸入性炭疽治疗困难，有条件的可用抗血清。