实验二 植物体内酸还原酶活力的测定

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二 植物体内硝酸复原酶活力的测定,植物生物学实验-植物生理局部,NO,3,-,和NH,4,+,是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田间条件下，NO,3,-,是植物吸收的主要形式。,硝酸盐的复原,硝酸盐,硝酸复原酶,亚硝酸盐,氨,亚硝酸复原酶,硝酸复原酶是一种诱导酶，在植物体内本来不含有，但在特定外来物质的如NO3-诱导下可以生成硝酸复原酶。,硝酸复原酶NR是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐复原为亚硝酸盐：,NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2O,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸或对氨基苯磺酰胺及-萘胺或萘基乙烯胺在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。,NR,【实验原理】,生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸复原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以g/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。,小麦的新鲜叶片诱导组和非诱导组,【实验材料】,冷冻离心机；分光光度计；天平(0.01g)；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；移液管(5、2、1mL)；洗耳球；试管架；(12)胶头滴管。,【实验器材】,标准曲线制作,取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序参加试剂，配成0-0.20g/mL的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度g/mL为横坐标X，吸光值为纵坐标r建立回归方程。,【实验步骤】,管号,1,2,3,4,5,6,7,试剂,取量mL,亚硝酸钠标准液,0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,蒸馏水,1.0,0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,0,1%磺胺,2,2,2,2,2,2,2,0.2%萘基乙烯胺,2,2,2,2,2,2,2,每管亚硝态氮浓度g/mL,0,0.02,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20,酶的提取 称取0.5-1g 鲜样诱导组和非诱导组分别进行，剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。,酶反响 取4个10 mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25保温30min。,终止反响和比色测定 30min后立即参加l mL磺胺溶液终止酶反响，再加l mL萘基乙烯胺溶液，显色30min后于4000rpm离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反响液中亚硝态氮浓度g/mL。,反应底物,酶反应管,粗酶液,/mL,0.1mol,/,L,KNO,3,磷,酸缓冲液,/mL,NADH,溶,液,/mL,0.1mol,/,L,pH7.5,磷酸缓冲液,/mL,非,诱导,对照,1,.0,1.,6,0,0.2,非,诱导,实验,1.0,1.,6,0.2,0,诱导,对照,1.0,1.,6,0,0.2,诱导,实验,1.,0,1.,6,0.2,0,【结果计算】,样品中酶活性g g-1h-1=,X 反响液酶催化产生的亚硝态氮浓度g/mL；,V1提取酶时参加的提取缓冲液体积mL；,V2酶反响时参加的粗酶液体积mL；,V3与磺胺等发生颜色反响的总体积mL；,W 样品质量g；,t 反响时间h。,X,*,V3,/V,2,*,V,1,W,*,t,【本卷须知】,硝酸复原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4下进行。,制作标准曲线时，从显色到比色时间尽可能保持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。,【思考与作业】,比色测定前参加磺胺和萘基乙烯胺的顺序不能颠倒的原因是什么？,