生物免疫分析技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四,章,章,生,生物,免,免疫,分,分析,技,技术,免疫,学,学方,法,法在,食,食品,分,分析,中,中正,得,得到,越,越来,越,越广,泛,泛的,运,运用,，,，其,中,中酶,联,联免,疫,疫吸,附,附法,（,（,ELISA,）已,经,经在,食,食品,工,工业,中,中广,泛,泛应,用,用，,它,它能,够,够用,于,于测,定,定人,们,们希,望,望含,有,有的,物,物质,，,，以,及,及不,希,希望,含,含有,的,的物,质,质。,例,例如,现,现在,人,人们,所,所关,注,注的,食,食品,安,安全,性,性问,题,题中,一,一些,物,物质,的,的检,测,测：,杀,杀虫,剂,剂、,药,药物,残,残留,物,物、,激,激素,、,、生,长,长素,、,、微,生,生物,毒,毒素,、,、真,菌,菌毒,素,素或,肠,肠毒,素,素、,天,天然,毒,毒素,，,，以,及,及一,些,些添,加,加剂,。,。,免疫,分,分析,法,法具,备,备有,效,效的,灵,灵敏,度,度、,特,特异,性,性、,快,快速,和,和低,成,成本,的,的优,点,点；,可,可对,大,大量,的,的样,品,品进,行,行常,规,规分,析,析；,能,能够,用,用于,样,样品,的,的定,性,性筛,选,选，,也,也能,够,够对,样,样品,进,进行,定,定量,测,测定,以,以确,定,定样,品,品中,待,待测,组,组分,的,的含,量,量。,4.1,免,免疫,的,的原,理,理,Ag+AbAg,Ab,特异,性,性、,灵,灵敏,性,性,在Ag，Ab,反,反应,中,中，,用,用容,易,易示,踪,踪的,化,化学,物,物质,标,标记,一,一种,反,反应,物,物，,以,以了,解,解反,应,应是,否,否发,生,生，,发,发生,部,部位,，,，以,及,及发,生,生的,程,程度,（,（即,对,对未,知,知成,分,分的,样,样品,进,进行,定,定性,、,、定,位,位及,定,定量,分,分析,）,）。,4.2,酶,酶联,免,免疫,法,法,免疫,酶,酶技,术,术：把抗,原,原抗,体,体的,免,免疫,反,反应,和,和酶,的,的高,效,效催,化,化作,用,用原,理,理有,机,机地,结,结合,起,起来,。,。它,具,具有,免,免疫,荧,荧光,试,试验,和,和放,射,射免,疫,疫试,验,验的,优,优点,，,，并,克,克服,上,上述,两,两种,方,方法,的,的缺,点,点。,酶标,记,记试,剂,剂制,备,备容,易,易、,稳,稳定,、,、有,效,效期,长,长，,免,免疫,酶,酶技,术,术的,敏,敏感,性,性接,近,近放,射,射免,疫,疫试,验,验，,可,可直,接,接肉,眼,眼观,察,察也,可,可借,助,助简,单,单的,仪,仪器,作,作定,量,量测,定,定，,所,所得,结,结果,比,比较,客,客观,。,。,酶免,疫,疫测,定,定或,免,免疫,酶,酶技,术,术是,指,指酶,标,标记,抗,抗体,或,或酶,标,标记,抗,抗体,进,进行,的,的抗,原,原抗,体,体反,应,应。它主,要,要包,括,括两,个,个方,面,面：,免疫,过,过氧,化,化物,酶,酶法,：,：以过,氧,氧化,物,物酶,作,作为,标,标记,，,，与,抗,抗原,或,或抗,体,体结,合,合，,然,然后,根,根据,酶,酶与,其,其底,物,物间,所,所产,生,生的,不,不溶,性,性颜,色,色产,物,物，,借,借助,于,于光,学,学或,电,电子,显,显微,镜,镜观,察,察细,胞,胞及,亚,亚细,胞,胞水,平,平的,抗,抗原,或,或抗,体,体。,酶联,免,免疫,吸,吸附,法,法：根据,可,可溶,性,性抗,原,原或,抗,抗体,与,与不,溶,溶性,固,固相,载,载体,结,结合,后,后，,还,还保,留,留其,免,免疫,活,活性,，,，结,合,合了,作,作为,标,标记,的,的酶,催,催化,作,作用,。,。,ELISA的,基,基本,原,原理,和,和方,法,法,ELISA的,种,种类,和,和变,化,化,ELISA的,特,特点,ELISA的,应,应用,实,实例,ELISA,4.2.1,基,基本,原,原理,它采,用,用抗,原,原与,抗,抗体,的,的特,异,异反,应,应将,待,待测,物,物与,酶,酶连,接,接，,然,然后,通,通过,酶,酶与,底,底物,产,产生,颜,颜色,反,反应,，,，用,于,于定,量,量测,定,定。,测,测定,的,的对,象,象可,以,以是,抗,抗体,也,也可,以,以是,抗,抗原,。,。,在这,种,种测,定,定方,法,法中,有,有3,种,种必,要,要的,试,试剂,：,：,固,相,相的,抗,抗原,或,或抗,体,体（,免疫,吸,吸附,剂,剂）,酶,标,标记,的,的抗,原,原或,抗,抗体,（,（,标记,物,物）,酶,作,作用,的,的底,物,物（,显色,剂,剂）,测量,时,时，,抗,抗原,（,（抗,体,体）,先,先结,合,合在,固,固相,载,载体,上,上，,但,但仍,保,保留,其,其免,疫,疫活,性,性，,然后,加,加一,种,种抗,体,体（,抗,抗原,）,）与,酶,酶结,合,合成,的,的偶,联,联物,（,（标,记,记物,）,），,此,此偶,联,联物,仍,仍保,留,留其,原,原免,疫,疫活,性,性与,酶,酶活,性,性，,当偶,联,联物,与,与固,相,相载,体,体上,的,的抗,原,原（,抗,抗体,）,）反,应,应,结合,后,后，,再,再加,上,上酶,的,的相,应,应底,物,物，,即,即起,催,催化,水,水解,或,或氧,化,化还,原,原反,应,应而,呈,呈颜,色,色。,颜色,反,反应,的,的深,浅,浅与,相,相应,的,的抗,体,体或,抗,抗原,量,量成,正,正比,，,，因,此,此可,借,借助,于,于颜,色,色反,应,应的,深,深浅,来,来定,量,量抗,体,体或,抗,抗原,。,。,这种,有,有色,产,产物,可,可用,肉,肉眼,、,、光,学,学显,微,微镜,、,、电,子,子显,微,微镜,观,观察,，,，也,可,可以,用,用分,光,光光,度,度计,（,（酶,标,标仪,）,）加,以,以测,定,定。,其方,法,法简,单,单，,方,方便,迅,迅速,，,，特,异,异性,强,强。,4.2.2,酶,酶及,其,其底,物,物,酶结,合,合物,是,是酶,与,与抗,体,体或,抗,抗原,半,半抗,原,原在,交,交联,剂,剂作,用,用下,联,联结,的,的产,物,物。,是,是ELISA,成,成败,的,的关,键,键试,剂,剂，,它,它不,仅,仅具,有,有抗,体,体抗,原,原特,异,异的,免,免疫,反,反应,，,，还,具,具有,酶,酶促,反,反应,，,，显,示,示出,生,生物,放,放大,作,作用,，,，但,不,不同,的,的酶,选,选用,不,不同,的,的底,物,物,，,，将,得,得到,不,不同,的,的颜,色,色反,应,应。,酶,底 物,显色反应,测定波长,辣根过氧化物酶,邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐,橘红色黄色棕色兰色蓝绿色,492,460,449425642,碱性磷酸酯酶,4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐,黄色红色,400500,葡萄糖氧化酶,ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰,黄色深蓝色,405,420,-半乳糖苷酶,甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG),荧光黄色,360,450420,4.2.3ELISA的,种,种类,和,和变,化,化,（一,）,）双,抗,抗体,夹,夹心,法,法,（二,）,）间,接,接法,（三,）,）竞,争,争法,（四,）,）双,位,位点,一,一步,法,法,（五,）,）捕,获,获法,测,测IgM,抗,抗体,（六,）,）应,用,用亲,和,和素,和,和生,物,物素,的,的ELISA,（一,）,）双,抗,抗体,夹,夹心,法,法,此法,适,适用,于,于检,验,验各,种,种蛋,白,白质,等,等大,分,分子,抗,抗原,步骤,：,：,A,将,将已,知,知抗,体,体吸,附,附于,载,载体,上,上，,温,温育,后,后清,洗,洗；,B,加,加入,待,待检,标,标本,溶,溶液,，,，使,溶,溶液,中,中的,抗,抗原,与,与吸,附,附的,抗,抗体,结,结合,，,，温,育,育后,清,清洗,；,；,C,加,加入,酶,酶标,记,记特,异,异性,抗,抗体,，,，温,育,育后,清,清洗,；,；,D,加,加入,酶,酶作,用,用底,物,物，,产,产生,显,显色,反,反应,，,，颜,色,色的,改,改变,与,与所,加,加的,待,待检,标,标本,溶,溶液,中,中的,抗,抗原,量,量成,正,正比,。,。,间接,法,法是,检,检测,抗,抗体,最,最常,用,用的,方,方法,，,，其,原,原理,为,为利,用,用酶,标,标记,的,的抗,抗,抗体,以,以检,测,测已,与,与固,相,相结,合,合的,受,受检,抗,抗体,，,，故,称,称为,间,间接,法,法。,（二,）,）间,接,接法,步骤,：,：,A,将,将已,知,知可,溶,溶性,抗,抗原,吸,吸附,于,于载,体,体（,聚,聚苯,乙,乙烯,板,板或,聚,聚乙,苯,苯乙,烯,烯小,珠,珠）,，,，经,温,温育,后,后清,洗,洗；,B,加,加入,待,待检,稀,稀释,血,血清,，,，若,血,血清,中,中有,相,相应,特,特异,性,性抗,体,体存,在,在则,与,与吸,附,附的,抗,抗原,结,结合,，,，温,育,育后,清,清洗,；,；,C,加,加入,酶,酶标,记,记的,抗,抗球,蛋,蛋白,抗,抗体,，,，此,时,时酶,标,标记,抗,抗抗,体,体与,吸,吸附,的,的抗,原,原抗,体,体复,合,合物,结,结合,，,，温,育,育后,清,清洗,；,；,D,加,加入,酶,酶作,用,用底,物,物（,或,或称,基,基质,）,），,酶,酶分,解,解底,物,物并,显,显色,，,，用,光,光电,比,比色,计,计测,定,定底,物,物显,色,色深,浅,浅，,即,即可,推,推知,抗,抗体,量,量。,（,三,三,）,）,竞,竞,争,争,法,法,此,法,法,可,可,用,用,于,于,检,检,测,测,小,小,分,分,子,子,抗,抗,原,原,。,。,步,骤,骤,：,：,A,将,将,已,已,知,知,抗,抗,体,体,吸,吸,附,附,于,于,固,固,相,相,载,载,体,体,表,表,面,面,，,，,温,温,育,育,后,后,清,清,洗,洗,；,；,B,将,将,可,可,能,能,含,含,抗,抗,原,原,的,的,待,待,检,检,溶,溶,液,液,和,和,酶,酶,标,标,记,记,的,的,已,已,知,知,抗,抗,原,原,溶,溶,液,液,以,以,适,适,当,当,比,比,例,例,混,混,合,合,，,，,加,加,入,入,已,已,包,包,被,被,的,的,载,载,体,体,孔,孔,中,中,，,，,温,温,育,育,后,后,清,清,洗,洗,；,；,C,加,加,入,入,酶,酶,作,作,用,用,的,的,底,底,物,物,，,，,产,产,生,生,显,显,色,色,反,反,应,应,。,。,色,色,深,深,表,表,示,示,结,结,合,合,的,的,酶,酶,标,标,记,记,抗,抗,原,原,多,多,，,，,而,而,待,待,检,检,溶,溶,液,液,中,中,未,未,标,标,记,记,的,的,抗,抗,原,原,量,量,少,少,；,；,反,反,之,之,，,，,色,色,浅,浅,表,表,示,示,结,结,合,合,的,的,酶,酶,标,标,记,记,抗,抗,原,原,少,少,，,，,而,而,待,待,检,检,溶,溶,液,液,中,中,抗,抗,原,原,量,量,多,多,。,。,对,照,照,管,管,由,由,于,于,只,只,加,加,酶,酶,标,标,抗,抗,原,原,，,，,与,与,固,固,相,相,抗,抗,体,体,充,充,分,分,结,结,合,合,，,，,故,故,分,分,解,解,底,底,物,物,显,显,色,色,深,深,；,；,测,测,定,定,管,管,的,的,显,显,色,色,程,程,度,度,则,则,随,随,待,待,测,测,抗,抗,原,原,和,和,酶,酶