蛋白质与DNA的相互作用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质与,DNA,的相互作用,刘兴汉,哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,分类：,与单链,RNA,结合,与茎环结构结合,与双链,DNA,结合：普遍性结合,特异性结合,蛋白质与,DNA,结合的特性：,1.DNA,识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。,2.,蛋白质和,DNA,的接触区只在,DNA,的一侧。,3.,在结合过程中，蛋白质和,DNA,都有构像改变。,4.,普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与,DNA,骨架的磷酸基团形成离子键。,5.,特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与,DNA,特定硷基接触。,蛋白质与,DNA,的普遍性结合中,DNA,特点：,蛋白质与,DNA,主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。,与,DNA,硷基序列特异性无关,结构的匹配性：,旋转对称性,特定距离的相反电荷,形成氢键基团排布上的匹配,形成足够大的范德华力,1.,蛋白质和,DNA,都存在,0.7nm,的重复距离,DNA,双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是,0.7nm,。,折叠，,N,原子间距离是,0.7nm,伸展,折叠,C,间距离是,0.7nm,螺旋，,Arg,和,Lys,被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是,0.7nm.,2.DNA,对称性,平移对称：,GCATCT,GCATCT,CGTAGA,CGTAGA,二重轴对称,GCATCT TCTACG,CGTAGA AGATGC,二重旋转对称,GCATCT AGATGC,CGTAGA TCTACG,旋转对称,GCATCT CGTACA,CGTAGA GCATGT,蛋白质与,DNA,特异性结合中,DNA,特点：,大沟内存在特异性识别信息,氨基酸与碱基对共平面,氨基酸和碱基对之间形成氢键,N,N,O,H,N,N,N,H,N,N,O,N,H,C,O,O,C,C,N,H,H,N,H,H,H,Glu,Agr,H,蛋白质与,DNA,普遍结合中蛋白质特点：,-,折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合,可能是通过识别小沟结构实现,1.,富含脯氨酸和碱性氨基酸,组蛋白有重复的,SPKK,Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg,PRGRP,序列与,A-T,碱基对结合,KPRGRPK,序列也能与小沟,A-T,结合,2.,碱性螺旋,组蛋白,H1C,端,57,个氨基酸,Lys,和,Gly,Lys,在螺旋两侧，,Gly,夹在中间,3.,蛋白磷酸化作用,SP X X,：,Ser,磷酸化,TPKK,：,Tyr,磷酸化,磷酸化后和,DNA,结合能力下降,磷酸化失去氢键,蛋白质与,DNA,特异性结合中蛋白质特点：,1.,蛋白质多形成二聚体,HTH,复合物,同源盒结构,亮氨酸拉链结构,NH,2,COOH,碱性氨基酸,Agr,和,Lys,锌指结构,Agr,和,G,形成氢键,细胞核蛋白质的提取,收集细胞，洗去血清和培养基,裂解细胞：,Triton X-100,NP-40,去胞浆成分,裂解细胞核：高浓度,KCl,:600mM,变更缓冲液浓度,快速抽提,裂解液：提取液：,10mM HRPES 250mM,Tris,1mM EDTA 60mM,KCl,60mM,KCl,1mM DTT,1mM DTT 1mM PMSF,1mM PMSF pH 7.9,0.5%NP-40,pH 7.9,1X10,7,细胞,100ul,裂解液、冰浴,5,分钟、离心,沉淀,用不含,NP-40,的裂解液洗一次,100ul,提取缓冲液,干冰异丙醇速冻，反复冻融,3,次,离心,沉淀,80,0,C,保存,凝胶滞后试验,1.,蛋白质和,DNA,结合复合物半衰期短,电泳缓冲液低离子强度,凝胶的笼效应,2.,探针以,20-200bp,为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。,3.,用竞争性抑制检测,DNA,与蛋白质结合的特异性,4.,加,3ug,Poly(dI-dC,),减少非特异性结合,5.,超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用,6.,只能确定结合，无法确定序列,DNA,足迹分析,DNA,足迹分析,1.DNAase,随机水解核苷酸磷酸二酯键,每一个,DNA,分子最好只切一次,2.,蛋白质与,DNA,结合保护,DNA,不被切割,3.,电泳用的是变性凝胶：,相差一个核苷酸,DNA,彼此分开,蛋白质从,DNA,分子上脱落,4.,可确定与蛋白质结合的,DNA,序列,5.DNA,序列是固定的,随机,PCR,凝胶阻滞试验：蛋白质和,DNA,结不结合，,不能确定结合的序列,DNA,足迹分析：蛋白质结合,DNA,的序列,不能确定序列硷基变化对,结合的影响,随机,PCR:,结合序列硷基变化对结合的影响,寡核苷酸设计与合成：,1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA,2.,引物合成,3.,标准结合反应寡核苷酸的合成,4.,电泳回收,探针标记：,合成的含随机序列的单链寡核苷酸,3,引物,32,PdCTP,dNTP,(,不包括,dCTP,),Klenow,酶,电泳纯化,凝胶阻滞试验纯化探针,1.,蛋白质与标准结合寡核苷酸结合,蛋白质与随机寡核苷酸结合,电泳（样品隔开，防污染）,2.,凝胶回收,3.,酚、氯仿去蛋白,4.PCR,（底物加,32,PdCTP,）,5.PCR,产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化,特异结合序列的克隆和序列分析：,酶切随机核苷酸序列与质粒重组,用引物对质粒序列进行分析,N1 N2 N3 N4 N5,A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32,C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16,G 4/0.01 6/0.14,6/0.14,9/0.21 19/0.43,T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01,4/0.01,T/A A/T/C C C G/A,超过,50%,：确定不可替换,25-50%,：两种硷基可替换,小于,25%,：没有硷基特异性,SouthWestern,杂交试验,确定与,DNA,结合的蛋白质分子量,蛋白质进行,SDS-Page,转移硝酸纤维素膜,与核酸探针杂交,亲和层析纯化,DNA,结合蛋白,凝胶阻滞检查,DNA,能否和蛋白质结合,足迹法，测序确定,DNA,序列,合成,DNA,制备亲和层析柱,蛋白过亲和柱纯化,谢谢,