高通量测序技术的类型原理及应用-ppt

,复旦大学,复旦大学,*,复旦大学,*,*,高通量测序技术,姓 名：赵 淑 莉,学 校：吉林大学,主要内容,类型及原理,2,应 用,3,4,1,概 述,致 谢,概 述,高通量测序技术,(,High-throughput sequencing,),又称,“,下一代,”,测序技术,”,、,深度测序,以能一次并行对几十万到几百万条,DNA,分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。,这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,。,类型及原理,目前，所说的高通量测序技术主要是指,454 Life Sciences,公司、,ABI,公司和,Illumina,公司推出的,第二代测序技术,以及,Helicos Heliscope TM,和,Pacific Biosciences,推出的,单分子测序技术,。,2005,年，,454 Life Sciences,公司,(,现已被,Roche,公司收购,),首先推出了革命性的基于,焦磷酸测序法,的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。,第二代测序技术,原理,：,酶级联化学发光反应,1,.,首先将,PCR,扩增的单链,DNA,与引物杂交，并与,DNA,聚合酶、,ATP,硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和,5,-,磷酸硫酸腺苷共同孵育。,第二代测序技术,2,.,在每一轮测序反应中只加入一种,dNTP,，若该,d,NTP,与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。,原理,：,酶级联化学发光反应,3,.,焦磷酸盐被硫酸化酶转化为,ATP,，,ATP,就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光,，,CCD,检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。,第二代测序技术,此后，,Illumina,公司和,ABI,公司相继推出了,Solexa,和,SOLiD(supported oligo ligation detetion),测序技术。,第二代测序技术,即生成新,DNA,互补链时，要么加入的,dNTP,通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的,dNTP,或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。,通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。,原理,：,与焦磷酸测序法的类似，核心思想都是边合成边测序,(sequencing by synthesis),。,第二代测序技术,第二代测序技术,优点：,操作极为简便,：,无需进行电泳,；,可以在芯片上进行高通量分析,；,大大节省了成本和时间,。,Illumina,公司,目前拥有三种测序平台，分别为,HiSeq 2000,、,HiSeq 1000,、,Genome Analyzer IIx,(,http:/ 3,和,SOLiD 4,两个测序平台。,从通量这个最直观的数字看来，,HiSeq 2000,领先于,SOLiD 4,。,HiSeq 2000,测序平台单次反应可以读取,200G,的数据，而,SOLiD 4,仅为,100G,左右。,第二代测序技术,就测序读长来说，,454,测序平台读长最长，目前已经达到,400nt,。因此，,454,平台比较适合对,未知基因组从头测序,，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。,Solexa,测序读长较,454,短，仅为,100nt,左右，但测序通量高、价位低，适合,基因组重测序,等。,SOLiD,读长也较短，但测序精度较高，特别适合,SNP,检测等。,在第二代测序平台不断完善和广泛应用的同时，以对,单分子,DNA,进行,非,PCR,测序,为主要特征的更新的测序技术也初显端倪,。,2008,年,4,月,Helico BioScience,公司的,Harris,等在,Science,上报道了他们开发的基于全内反射显微镜,(total Internal reflection microscopy,TIRM,),的测序技术,单分子测序技术,。,单分子测序技术,基于全内反射显微镜,(total Internal reflection microscopy,TIRM),的测序技术,原理,：,1,.,将,待测,DNA,样品,随机打断,成小片段，在每个小片段的末端加上,poly-dA,；,2.,将,小片段,DNA,模板与固定在检测芯片上的,poly-dT,引物进行,杂交,并精确定位，并逐一加入,荧光标记,的末端,终止子,；,单分子测序技术,3.,洗涤、成像，切开荧光染料和抑制基团,；,4.,洗涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入,；,5.,这样通过掺入、检测和切除的,反复循环,，即可实时读取大量序列。,单分子实时技术,(,SMRT,),单分子测序技术,该技术利用单分子技术和,DNA,聚合酶，在聚合反应的同时就可以读取测序产物。,SMRT,测序技术在测序速度、读长和成本方面有着巨大的优势和潜力。,Ion PGM,测序技术,原理,基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微孔中固定,DNA,链，随后依次掺入,ACGT,，,随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到。,单分子测序技术,主要优点：,大大节省了成本和时间,主要缺点：,测序仪的价格昂贵,单分子测序技术,目前,Helico BioScience,公司的,HeliScope,测序仪售价近百万美元，这是一般实验室和科研单位所不能承受的。,Life Techologies,公司推出的,Ion Personal Genome Machine(PGMTM,),测序仪价格仅为普通测序仪的,1/10,，,而且,研究人员能够在,2h,内获取从,1,0Mb,到,1Gb,以上高精确度序列,。,单分子测序技术,大规模平行测序,(massively parallel signature sequencing,，,MPSS),：,它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极致,。,高通量测序技术的优点,成本低廉,：,利用高通量测序技术进行人类基因组测序，耗资不到传统测序法的,1%,。,高通量测序技术的优点,高通量测序技术有完美的定量功能,：,这是因为样品中某种,DNA,被测序的次数反映了样品中这种,DNA,的丰度。这一点有望取代以前的基因表达芯片技术用于基因表达的研究。,高通量测序技术的应用,大规模基因组测序,基因表达分析,非编码小分子,RNA,的鉴定,转录因子靶基因的筛选,DNA,甲基化相关研究,其他,全基因组测序,高通量测序技术在发展初期由于读长较短，使其在对未知基因组从头测序,(,denovo Sequencing,),的应用受到限制，只能用于基因组重测序。,基因组重测序,是指对已知基因组序列的物种进行不同个体的,基因组测序,，并在此基础上对个体或群体进行,差异性分析,。,高通量,RNA,测序及其在转录组和基因表达调控,上的应用,最近科学家们将高通量测序技术应用于转录组分析开发出了,RNA,测序技术,(RNA-Seq),，该技术能够在全基因组范围内,检测基因表达,情况，进行,差异基因筛选分析,。,由于,RNA-Seq,技术具有通量高、可重复性高、检测范围宽、定量准等特点，已经广泛应用于细菌、拟南芥、水稻和人类等生物,转录组的研究,。,转录组研究,是从整体水平研究基因功能以及基因结构。但是，多数研究人员感兴趣的是某一特定的生物过程、发育阶段或处理后的基因表达情况。,建立在高通量测序基础上的数字化基因表达谱,(digital gene expression profiling),分析无需预先针对已知序列设计探针，即可对,任何生物整体转录活动,进行检测，因此应用范围更加广泛。,高通量,RNA,测序技术另一个广泛应用的领域是,小,RNA,的研究,。,小,RNA,在植物的生长、发育和外界胁迫应答等方面具有重要功能。,但由于小,RNA,序列短、同源性高，因此利用基因芯片检测小,RNA,非常困难。,高通量测序技术不但能够克服这一难题，而且能够,发现新的小,RNA,。目前，高通量测序技术已经成功的应用于拟南芥、水稻和小麦等生物小,RNA,的研究。,ChIP-Seq,技术及其在,DNA,和蛋白质相互作用研究中的应用,染色质免疫共沉淀,(chromatin immuno-precipitation,，,ChIP),技术是研究体内蛋白质与,DNA,之间相互作用的强有力工具，在转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究中被广泛应用。,染色质免疫共沉淀测序,(chromatin immune,precipitation sequencing,，,ChIP-Seq),技术充,分结合了,ChIP,和高通量测序技术的优势，能够在全基因组范围内高效地研究目的蛋白的结合位点。,该技术的原理,：,1.,通过,ChIP,技术利用抗体特异性地富集交联的,目的蛋白,-DNA,复合体,；,2.,将得到的,DNA,片段进行,高通量测序,；,3.,将获得的数百万条序列标签,精确定位,到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白或转录因子等,互作的,DNA,区段信息,。,基因组,DNA,甲基化分析,DNA,甲基化在维持细胞正常功能、遗传印记和胚胎发育过程中起着极其重要的作用。,新一代高通量测序技术使得,基因组整体水平高精度的甲基化检测,成为现实。,目前，高通量测序技术已经广泛应用于拟南芥、水稻、蚕和人等生物,DNA,甲基化的研究，并取得了丰硕的成果。,目前，已经建立了至少三种依赖于高通量测序的,DNA,甲基化分析技术,：,甲基化,DNA,免疫共沉淀测序,(methylated DNA immunoprecipitation sequencing,，,MeDIP-Seq),；,甲基结合蛋白测序,(methyl-binding protein sequencing,，,MBD-Seq),；,亚硫酸氢盐测序,(bisulfite-sequencing,，,BS-Seq),。,MeDIP-Seq,和,MBD-Seq,首先通过特异性结合甲基化,DNA,的,MBD2b,或,5-,甲基胞嘧啶抗体,富集,高甲基化的,DNA,，然后再对富集到的片段测序,；,MeDIP-Seq,和,MBD-Seq,都是基于富集的原理，二者是相辅相成的。,MeDIP-Seq,对高度甲基化和,高密度,的,CpG,更加敏感，而,MDB-Seq,对高度甲基化和,中等密度,的,CpG,更加敏感,；,BS-Seq,不经过富集直接测序。,存在的问题,测序速度提高了，但后续的海量测序数据的分析却成为一大难题,。,不适合小规模测序,。,新一代测序仪价格昂贵,。,Hiseq 2000,高通量测序仪,solexa,高通量测序仪,发展趋势,焦磷酸测序等测序平台都,依赖生物化学反应,。这不但加大了测序成本，而且浪费了时间，不利于测序速度的提升。因此，非光学显微镜成像、纳米孔和生物孔等直接测序技术是未来的发展方向。,相信随着高通量测序成本的进一步降低和对海量数据处理能力的不断提高，高通量测序将成为一项常规的实验手段，并为生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。,谢 谢！,