实验六抗体效价的Elisa测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二,酶联免疫吸附测定,BSA,抗体效价,1.,目的要求,(1)学习酶联免疫吸附测定,的基本,原理。,(2),掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。,2.,基本原理,免疫酶技术:,酶标,Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定,Ab/Ag。,免疫反应：一次或数次 具,Ag,Ab,特异的免疫学反应,酶促反应：只进行一次,显示出生物放大作用，灵敏度,ng,pg,60,年代初期，,Averameas,&,Ram,等,建立了免疫酶技术,(,immunoenzymatic techniques),利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶,-,人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶,-,抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定,酶联免疫吸附测定(,enzyme-linked immunosorbent assay,简称为,Elisa)-,是在免疫酶技术(,immunoenzymatic techniques),的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。,1974年,Voller,等,用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合,操作更方便，易重复,灵敏度可高达,ng（10,-9,g）,至,pg(10,-12,g)，,(,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),免疫标记技术,应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定,标记抗体或抗原,荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂,镜检观察或进行自动化测定,荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等,直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究,酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测,常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(,horserad peroxidase,简称,HRP)、,葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。,酶标技术,戊二醛法，过碘酸氧化法,将酶与,Ab,交联在一起,Ag-Ab-,抗,Ab-HRP,TMB+H,2,O,2,产物（黄色，,OD,450,)+H,2,O,图一直接型,Elisa,图二间接型,Elisa,图三 双抗体夹心型,ELISA,图四 固相抗体竞争型,ELISA,未知抗原量=,A（1）-A（2）,每次反应后都要反复洗涤？,保证反应的定量反应,防止重叠反应，引起非特异现象。,Partially purified,inactivated HIV antigens,antigens pre-coated onto an ELISA plate,Patient serum which contains antibodies.If the patient is HIV+,then this serum will contain antibodies to HIV,and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.,Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme.This is the second antibody,and it binds to human antibodies.,substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.,HIV,(,human immunodeficiency virus)detection,positive,negative,Protein protein interaction-ELISA,1.Direct elisa different epitope,Coat with prey protein,Incubate with bait protein,Pimary Ab anti bait protein-,2.Competitive elisa same epitope,Coat with bait pr,Incubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein,4.,操作方法,4.1 包被特异性抗原,:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10,Og/ml，,每凹孔加100,L，,加盖置4过夜(37 2,h),【,已完成,】,次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释,/,洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置,2min,后倾去，后两次静置,1min,。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。,4.2 封闭,:每孔中,加满,封闭液（约,300ul,多），加盖或用封口膜封板，置37恒温箱60,min，,倾去孔内液体，按上法洗涤3次。,4.3 加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(,PBS/Tween),:,待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(,PBS/Tween),各1,OOL,加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱1,h，,使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。,1,2,3,4,5,6,7,8,PBS/Tween,1:100阴性血清,1:,1,000,1:,5,000,1:,10,000,1:,50,000,1:,100,000,1:,500,000,阳,性血清,4.4 加酶标抗体,:加入,HRP-,抗体(抗抗体，本实验中,已经,根据说明书稀释一千倍,),，每孔加,l00L，,封板后置37温育,lh，,按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。,4.5 显色,:,首先按每,10mLOPD,应用液加入,0.15mLH,2,O,2,处理,。每孔加入,OPD,应用液1,OOuL、,反应板置室温暗处530,min。,当显示明显黄色时应及时终止反应。,4.6 终止反应,:每孔加入,10OL,2mol/L H,2,SO,4,。,由黄色变为橙色。稳定35,min,即可比色测定。,4.7 检测,:用酶联免疫测定仪，以,PBS/Tween,孔为对照、测波长为4,9Onm,时各孔光吸收（,A）,。,计算阳性血清与阴性血清,A,值之比(,Positive/negative，P/N)，,当,P/N2.1,时为阳性，,P/N2.1,而1.5为可疑，,P/N1.5,为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。,用“”“”表示，超过规定吸收值（0.20.4）的标本均属阳性。,注意事项,(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100,g,之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%,NaN,3,，4,贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。,(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。,(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反应35,min,后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。,(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。,自动酶标仪（,Elx800UV,）,使用程序,1,开机，进行,System self-test,2,按“,DEFINE”,键，进入“,SELECT ASSAY NUMBER”，,用“,NUMERIC”,或“,OPTION”,键输入测试号（注：,assay 01,为,quick read，,最大测试号为55）；按“,ENTER”,键修改测试的“,NAME”；,再按“,ENTER”,键进入下列菜单：,按“,METHOD”,键选择测试的波长类型（,Single,或,Dual）、,波长大小(340、405、,450,、,490或630,nm),、,微孔板类型(,96孔,、48孔或24孔)。,按“,MAP”,键选择阅读方式(,Auto,或,Manual)、,阅读方向（,Down,或,Across）、,重复方向（,Down,或,Across）、,阅读起始位置（输入编号）、空白,Map（,Air,、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。,3,按“,READ”,键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。,4 按“,MAIN MENU”,键回到主菜单，关闭电源。,酶标板的清洗：,采用,ELx50TM,型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗,免疫检测,灵敏度,辣根过氧化物酶：1020,pg,碱性磷酸酶：1050,pg,免疫金：125,pg,125,I:5,0100,pg,放射自显影术：将含放射性同位素置,X,感光胶片上感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带,