实验亲和层析纯化IgG

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物分离与纯化实验,共,34,学时,持续改进,协作,实验报告：,1.,信息栏填全，遗漏项：同组人员；,2.,结果计算：过程完整,3.,讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。,上次实验总结,实验（三）血清中抗体纯化（,16,学时）,配基 特异性,Protein A,许多,IgGs,的,Fc,片断,Protein G,许多,IgGs,的,Fc,片断,Antigen,特异的抗体,Anti-IgG,特异免疫球蛋白,抗体纯化配基类型,族特异性,专一特异性,二、实验原理,低,pH,下洗脱,用,rProtein A Sepharose,分离,IgG,Column:HiTrap,Protein A FF,结合缓冲液,:20 mM,磷酸钠,pH 7.0,洗脱缓冲液,:0.1 M,甘氨酸,-HCl,pH 3,注意,:,为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于,1 M Tris-HCl,pH 7.5,中,二、实验原理,二、实验原理,蛋白,A,和 蛋白,G,的结合特异性,种属蛋白,A,蛋白,G,结合结合,人,IgA,可变的-,IgD-,IgE,IgG,1,+,IgG,2,+,IgG,3,-+,IgG,4,+,IgM*,可变的-,鸟类蛋黄,IgY,-,牛+,狗+,山羊-+,豚鼠,IgG,1,+,IgG,2,+,仓鼠,+,马,+,考拉-+,骆驼-+,种属蛋白,A,蛋白,G,结合结合,恒河猴,+,大鼠,IgG,1,+,IgG,2a,+,IgG,2b,+,IgG,3,+,IgM*,可变的-,猪,+,兔,+,小鼠,IgG,1,-+,IgG,2a,-+,IgG,2b,-+,IgG,3,+,绵羊,+/-+,+,相对结合强度,弱或不结合,三、实验材料,纯化,试剂：,磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、,95%,乙醇；均为分析纯。,容器：,50ml,烧杯,/,三角瓶,/,试管,10,个；,15ml,收集试管,5,个；,100ml,三角瓶,5,个；,250ml,烧杯,5,个,填料：,Protein A,层析柱,：,XK10,或预充柱,装柱体积,：,2ml,血清,：,2ml,滤器：,0.45,m,针头式滤器,5,个；,SDS-PAGE:,缓冲液：,平衡液：,20mM,磷酸二氢钠，,150mM,氯化钠，,pH7.2,；,(1L),冲洗液：,20mM,磷酸二氢钠，,0.5M,氯化钠，,10mM EDTA,二钠，,pH7.2,；,(1L),洗脱液：,0.1M Glycine-HCl,，,pH3.5,；,(1L),清洗液：,6mM,氢氧化钠。,(1L),稀释血清：,取,2ml,血清，用平衡缓冲液稀释,5,倍，,0.45um,针头滤器过滤。标记为,S.,三、实验材料,纯化,三、实验材料,SDS-PAGE,试剂：,1.2x,样品缓冲液,2.,凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺,30g,，甲叉双丙烯酰胺,0.8g,，加重蒸水溶解后，定容到,100ml,，,过滤。,3.pH8.9,分离胶缓冲液：,Tris 36.3g,，加,1mol/L HCl 48ml,，加重蒸水,80ml,使其溶解，调,pH8.9,，定容至,100ml,，,4,保存。,4.pH6.7,浓缩胶缓冲液：,Tris 5.98g,，加,1mol/L HCl 48ml,，加重蒸水,80ml,使其溶解，调,pH6.7,，定容至,100ml,，,4,保存。,5.TEMED,（四乙基乙二胺）原液,6.10%,过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）,7.pH8.3 Tris-,甘氨酸电极缓冲液：称取,Tris 6.0g,，甘氨酸,28.8g,，加蒸馏水约,900ml,，调,pH8.3,后，用蒸馏水定容至,1000ml,。置,4,保存，临用前稀释,10,倍,（减半配制）,。,8.,考马斯亮蓝,G250,染色液：称,100mg,考马斯亮蓝,G250,，溶于,200ml,蒸馏水中，慢慢加入,7.5ml 70%,的过氯酸，最后补足水到,250ml,，搅拌,1,小时，小孔滤纸过滤。,器材：,电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。,三、实验试剂,浓度测定,考马斯亮蓝,G-250,蛋白染色液,(1),牛血清白蛋白标准液（,100ug/ml,）,精确称取,0.010g,牛血清白蛋白，溶于约,50ml,蒸馏水，定容到,100ml.,(2),考马斯亮蓝,G-250,试剂,取,100mg,考马斯亮蓝,G-250,，溶于,50ml 90%,乙醇中，加入,85%,正磷酸,100ml,，最后用蒸馏水定容到,1000ml,，此试剂在常温下可放,1,个月。,四、实验步骤,1.Protein A,纯化,：,1,）,装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取,20ml,蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为,20ml,的标记，然后打开止水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留,0.5-1m,的水。,ProteinA,填料中,加入适量,平衡缓冲液,，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上层有一水层后打开止水夹，再用,20-40ml,平衡,缓冲液不断加入柱内洗脱，最后待胶床表面仅有,1-2,厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应符合无气泡、无节痕、床面平正,。,2,）,上样：,血清,让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面中央,2ml,稀释血清，,待样液几乎全部进入胶床表面后，关止水夹，,室温下样品与填料结合,15min,。,实验步骤,1.Protein A,纯化,：,3,）冲洗,：,加,2,倍柱体积冲洗缓冲液，,打开止水夹，,控制流出速度为,2ml/min,，,并用试管收集流出液,(,记为,W),，在床表面仅有,1,毫米左右液层时，关止水夹,，再加入,2,倍柱体积平衡缓冲液冲洗填料，,床表面仅有,1,毫米左右液层时，关止水夹,，。,4,）,洗脱收集：取刻度试管,2,支编号，柱床上面加,3,倍柱体积洗脱,缓冲液,，控制止水夹流出,1,倍柱体积洗脱液后，关止水夹，室温下柱料与洗脱液孵育,15min,，打开止水夹控制流出速度为,1ml/min,收集,2,倍柱体积（记为,E1,），待,床表面仅有,1,毫米左右液层时,再加入,3,倍柱体积洗脱,缓冲液,，收集,2,倍柱体积记为,E2,。,5,）,收集结束后，,加入清洗液（,6M NaOH,）洗涤,2cv,，平衡液,5cv,。,分,离胶及浓缩胶的制备,：,1,将玻璃板、样品梳、,Spacer,用洗涤剂洗净，用,ddH2O,冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；,2,将两块洗净的玻璃板之间加入,Spacer,，按照说明书提示装好玻璃板；,3,按以下配置,10%,分离胶及浓缩胶,四、实验步骤,2.SDS-PAGE,纯度测定,浓缩胶,（,5 ml）,双蒸水,0.5 mol/L pH 6.8,Tris-HCl,30%胶贮液,10%SDS,TEMED,10%AP,5%,3.4ml,0.63 ml,0.83ml,50 l,5 l,50 l,分离胶,（,10 ml）,双蒸水,1.5 mol/L pH 8.8,Tris-HCl,胶贮液,10%SDS,TEMED,10%AP,7.5%,12%,10%,4.8ml,3.3ml,4.0ml,2.5ml,2.5 ml,2.5ml,2.5ml,4 ml,3.3 ml,100 l,100 l,100 l,10 l,10 l,10 l,100 l,100 l,100 l,3,、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约,5 cm,左右，之后加少许蒸馏水，静置,30,分钟。凝胶配制过程,要迅速,，催化剂,TEMED,要在注胶前再加入,，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,4,、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘,5 mm,处，迅速插入样梳，静置,10,分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。,四、实验步骤,2.SDS-PAGE,纯度测定,5,、样品处理：还原样品：取,30ul,样品（,S,W,E1 E2,），加入,30ul,还原上样缓冲液，,100,水浴,5min,，非还原样品加入,30ul,非还原上样缓冲液室温孵育,5min,。,6,、加样：拔出样梳后，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白,Marker,。其中,S,和,Marker,加样量为,2 l,，,W,E1,，,E2,加样量为,15 l,，还原与非还原样品间空一孔道。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。,四、实验步骤,2.SDS-PAGE,纯度测定,7,、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在,160 V,，当进入分离胶后改为,240 V,，溴酚蓝距凝胶边缘约,5 mm,时，停止电泳。,8,、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液微波煮沸后，染色,10min,左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。,9,、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水冲洗染色液，再用微波煮沸后的脱色液脱色，可更换,2,次，直到蛋白质区带清晰。,四、实验步骤,2.SDS-PAGE,纯度测定,实验步骤,3.,蛋白质含量测定,1,）,取洗脱液,E1,，,E2 0.5,毫升，用蒸馏水稀释至,5,毫升，然后吸取稀释后的酶洗脱液,G-25 0.5,毫升，用考马斯亮蓝,G-250,染色法测定其蛋白质含量。,0,1,2,3,4,5,6,7,100ug/ml牛血清,蛋白标准液(ml),0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,样品待测液,(ml),0.5,0.5,蒸馏水,(ml),1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0.5,0.5,考马斯亮蓝,G-250,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,各管均匀，室温下放置,5分钟，在,=595n处比色,吸光度（,OD,595,）,蛋白质含量（,ug）,0,20,40,60,80,100,A,595,管号,数量,项目,标准曲线的制作和样品的测定,将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取,marker,中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线：,logMW=K-bX,以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量,分析抗体的纯度及分子量（还原，非还原）,计算,抗体总蛋白得率。,五、结果,下面开始实验！,