实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验一,质粒的提取,和,琼脂糖,凝胶电泳检测,(,高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克,),实验目的,实验原理,实验仪器、材料与试剂,实验步骤,实验结果及讨论,一、实验目的,了解,高纯质粒小量制备试剂盒,和,碱法,提取质粒的,原理,掌握,百泰克,高纯质粒小量制备试剂盒方法,提取质粒的,方法,二、实验原理,(百泰克,高纯质粒小量制备试剂盒方法),本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。,一、原理简介,本试剂盒采用,改进,SDS-碱裂解法,裂解细胞，离心吸附柱内的,硅基质膜,在,高盐、低PH值,状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过,去蛋白液,和,漂洗液,将杂质和其它细菌成分去除，最后,低盐、高PH值,的,洗脱缓冲液,将,纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱,。,实验原理（碱法）,质粒是一种,细菌染色体外,的、具有自主复制能力的、,共价闭合环状,超螺旋,结构的小型DNA分子。,碱裂解法,提取质粒是实验室常用的方法。,这种方法是根据,共价闭合环状质粒DNA,与线性染色体DNA,在,拓扑学上的差异,来分离它们。,在碱性条件（,pH12.5,）下，,线性,染色体DNA的双螺旋结构,解开而变性,，,质粒,DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，,紧密结合,在一起。,当加入,乙酸钾,恢复至,中性,时，染色体DNA分子难以复性，而,质粒DNA,分子,很快复性,，离心时,染色体,DNA与细胞碎片一起被沉淀出来,，而,质粒DNA,则,留在上清液,中。,用,异丙醇,或,乙醇沉淀,后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,载体结构的三大要素,：,多克隆位点,选择标记（耐药性，,LacZ,）,独立的复制单位,载体种类,：,质粒,噬菌体,酵母人工染色体（,YAC,）,反转录病毒载体,表达载体等,pBC SK map,三、实验仪器、材料与试剂,（一）,仪器,恒温摇床,超净工作台,高压灭菌锅,高速台式离心机,微量取液器、,1.5mLEP,管,LB,液体和固体培养基,卷纸、无水乙醇、双蒸水,（二）材料和试剂,含,pUM,-T,(pMD18-T,或,KS,，,pRT101),质粒的大肠杆菌,DH10B,（,DH 5,或,HB101,）。,含外源基因的重组,pUM,-T,(pMD18-T,或,KS,，,pRT101),质粒的大肠杆菌,DH10B,（,DH 5,或,HB101,）。,氨苄青霉素（,Amp,）：用无菌水配制成,50-100 mg/ml,溶液，置,-20,冰箱保存备用。,pMD18-T Vector,LB,液体培养基,（,1L,）：,胰蛋白胨,10g,酵母提取物,5 g,NaCl,10 g,。,加去离子水至,800ml,搅拌，使溶质完全溶解，用,NaOH,调节,pH,值至,7.0,，加入去离子水至总体积为,1,升，高压蒸汽灭菌,20,分钟。,5.,LB,固体培养基（,1L,）：,在上述,LB,液体培养基（,1L,）中加入,琼脂粉,(Agar),15g,。,四、实验步骤,百泰克高纯质粒小量制备试剂盒,第一次使用前请先在,15ml(,25ml,),漂洗液,WB,中加入,45ml(,75ml,),无水乙醇,!,将,RNase,A,全部加入溶液,P1,中，,混匀,，每次使用后置于,2-8,保存,。,取,毫升,过夜培养的菌液，,9000rpm,，离心,30,秒,，,弃上清，收集菌体,，尽可能的,倒干上清,。,处理超过,1.5,毫升菌液可以离心去上清后，在同一个,1.5ml,管内加入更多的菌液，重复步骤,1,，直到收集到足够的菌体。,2.用,250,l,溶液,P1,重悬菌体沉淀,，,涡旋振荡,至彻底悬浮。,如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和 纯度偏低。,3.加,250,l,的溶液,P2,，,温和的,上下翻转,6-10次,使菌体,充分裂解,，直到溶液变得,清亮,。,温和的混匀，不要剧烈震荡，,以免基因组DNA剪切断裂！,所用时,不应超过5分钟,！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得,清亮粘稠,，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。,4.,加,400,l,溶液,P3,，,立即温和,的上下翻转,6-10次,，室温,放置5分钟,。室温,13，000rpm离心10分钟,，,小心,取上清。,5.(将,吸附柱,安置于,收集管,上，加入,500,l,溶液,P4,，室温,13,000rpm离心1分钟,，弃滤液；),将,上一步所得上清液,加入吸附柱,AC,中（吸附柱放入收集管中），,13,000rpm离心1分钟,，弃滤液。,6.加入,500,l,去蛋白液PE,，,13,000rpm离心30-60秒,，弃滤液。,此步骤为了,去除痕量核酸酶,等杂质，如所用 菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue和DH5等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。,加入,500,l,漂洗液,WB,（请先检查是否已加入,无水乙醇,！），,13,000rpm,离心,30-60,秒,，弃滤液。,重复,步骤,7,一次，,13,000rpm,离心,30-60,秒,，弃滤液。,空柱,13,000rpm,离心,2,分钟,。,室温,放置,3-5,分钟,，除去残留乙醇。,9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在,吸附膜的,中间部位,加,60-100,l,洗脱缓冲液,EB,或,双蒸水,（洗脱缓冲液事先在,65-70水浴中加热效果,更好）,室温,放置,1分钟,，13,000rpm离心1分钟,洗脱质粒,DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20保存。,洗脱体积,越大，洗脱效率越高,，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是,最小不应少于50,l,，,体积过小降低质粒洗脱效率,，减少质粒产量。,五、实验结果与讨论,1.实验结果,2.讨论,附I：碱法提取质粒的原理和方法,(一)试剂等,1.,Solution,50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8.0),高压灭菌后，4保存备用。,2.,Solution,(现用现配制),0.2 mol/L NaOH,1%SDS,3.,Solution,（100 ml）：,5mol/L KAc 60 ml,冰醋酸 11.5 ml,水 28.5 ml,配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （,pH 4.8,）。,4.,胰RNA酶,：将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。,5.,氯仿，乙醇，70%乙醇,。,（二）实验步骤,用灭菌的牙签挑取单菌落放入,50ml LB,液体培养基（含,Amp,0.1,mg/ml,）,中，,37,振荡培养,过夜。,将菌液倒入,1.5,ml,Eppendorf,管中，,10,000 rpm,离心,1min,，,去掉上清液，重复,两次,。,沉淀悬于,200L,SolutionI,中,涡旋使,充分悬浮,。,加入,300L,SolutionII,，混,匀（注意,动作轻,），冰箱,3,放置,5 min,。,加入,300L,SolutionIII,混匀（注意,动作轻,），冰箱,3,放置,5 min,。,12,000rpm,，,离心,5min,，,将上清移至,1,个新,Eppendorf,管中，注意所取体积（约,600 L,）。,加入,等体积氯仿,（约,600 L,），,混匀,（注意动作轻）。,12,000rpm,，,4,，,离心,10min,，,取,上清,液。,上清液,中加入,预冷的等体积异丙醇,，,-20,沉淀,2030 min,。,12,000 rpm,离心,15 min,。,去上清，,沉淀,加入,500L,70%,乙醇,洗涤,2,次,（,12,000 rpm,离心,3,分钟）。,去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或,真空干燥,沉淀。,每管中加入,25L,无菌水,1L,RNase,，,37,溶解质粒,DNA,。,(三)实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，,提取量较大，便于操作,。,如有,蛋白质残留,，干燥后,不透明,，而呈白色,。,附II：,B型质粒小样快速提取试剂盒,北京博大泰克（BioDev）生物基因技术有限责任公司,(一)概述,采用碱裂解-中和法，应用常规台式高速离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒DNA的上清通过设计独特的,离心吸附柱式,结构时，被,特殊硅基质材料,高效、专一地吸附。被吸附的质粒DNA随后可用,洗脱缓冲液,从离心吸附柱上洗脱下来。,(二)试剂盒组成及包装,STE,缓冲液,(,溶液,1),Lysis,Buffer(,溶液,2),3 M,NaAc,PH 4.8(,溶液,3),结合缓冲液,浓缩漂洗液,洗脱缓冲液,离心吸附柱,废液收集管,RNaseA,(10mg/ml),(三),实验准备,试剂盒使用前，在,5,mL,溶液,1,中加入,300l,RNaseA,（,RNaseA,终浓度为,0.6mg/mL,）。溶液,1,使用完毕后，立即于,4,保存。,浓缩漂洗液,使用前按,1,：,3,的比例加入,无水乙醇,，例如,15,mL,浓缩漂洗液中加入,45,mL,无水乙醇，混匀后方可使用。,实验前检查,溶液,2,及,结合缓冲液,是否有高盐结晶。如有结晶，将盖拧松后加热,10-15,秒，高盐结晶溶解后再使用。,(四)实验操作步骤,收集,1.5-3mL,菌液的沉淀于,1.5,mL,Eppenforf,离心管中，加入,100l,溶液,1,，振荡至彻底悬浮。,加入,150,l,溶液,2,，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上,1-2,分钟（时间勿超！）。,加入,150,l,溶液,3,，立即温和颠倒离心管数次，室温放置,5,分钟。,12,，,000rpm,离心,12,分钟。,将,420l,结合缓冲液,加入离心吸附柱中，然后将步骤,3,中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，,12,，,000rpm,离心,30,秒钟。倒掉废液收集管中的废液。,加入,750,l,漂洗液,于离心吸附柱中，静置,1,分钟，,12,，,000rpm,离心,15,秒。倒掉废液收集管中的废液。,重复一次,。倒掉废液后，,再次,于,12,，,000rpm,离心,2,分钟，尽量除去漂洗缓冲液。,下心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的,1.5,mL,Eppendorf,离心管中，加入,洗脱缓冲液,，常规,50l,，室温放置,2-5,分钟，,12,，,000rpm,离心,1,分钟。,附III：H.Q.&.Q.高纯度质粒微量试剂盒,（HP Plasmid Miniprep Kit）,A样本制备,将带有目的质粒的E.coli,接种于裝有5ml LB/氨苄青霉素(50g/ml)培养基的1020ml培养管中，37搖床培养,1216 hr,，以,扩增质粒,。,建议使用endA 敏感型的E.coli 菌株来作常规质粒的分离，例如,DH5,和JM109等菌株。,B操作方案,1.取,1.55ml,的菌液，于室温下,10,000g,离心,1min,以沉淀菌种。,2.,倒出,或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入,250l,的,ZL-IRNaseA,混和液，,漩涡振荡,使细胞,完全重新悬浮,。,细胞沉淀的,完全重悬,对于获得,高的产量,是十分重要的。,3.往重悬混和液中加入,250l,ZL-II,，,轻轻翻转,试管,46次,混和溶液，以获得一,澄清的裂解液,。,如有必要，可把裂解液置于室温静置2min。,避免剧烈混和裂解液,，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。当使用完ZL-II以后，须盖紧其瓶盖保存好。,4.往上述混和液中加入,350l,ZL-III,，并,温和,地上下,颠倒离心管数次,，直至形成,白色絮狀沉淀,。于室温下,10,