rqpcr技术的原理及临床应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2022/1/9,#,rqpcr技术的原理及临床应用,rqpcr技术的原理及临床应用,第1页,实时荧光定量,PCR,定义：,在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积实现了,实时监测,整个,PCR,进程，对,起始模板,进行,定量,分析方法。,rqpcr技术的原理及临床应用,第2页,与普通,PCR,区分,普通,PCR,技术：,在,PCR,结束后对,终点产物,进行定量分析。,实时定量,PCR,技术：,实时检测,PCR,扩增，在扩增指数期对,起,始模板,进行定量。,rqpcr技术的原理及临床应用,第3页,rqpcr技术的原理及临床应用,第4页,荧光阈值,是在荧光扩增曲线上人为设定一个值，它能够设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，普通荧光阈值设置是 基线（背景）荧光信号标准偏差,10,倍。,每个反应管内荧光信号抵达设定阈值时所经历循环数被称为,CT,值,（,threshold value,）。,rqpcr技术的原理及临床应用,第5页,rqpcr技术的原理及临床应用,第6页,rqpcr技术的原理及临床应用,第7页,荧光定量,PCR,化学原理,非特异性荧光标识：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标识：,2,、,TaqMan,rqpcr技术的原理及临床应用,第8页,1,、,SYBR Green,法,rqpcr技术的原理及临床应用,第9页,SYBR Green,熔解曲线分析,rqpcr技术的原理及临床应用,第10页,溶解曲线,溶解曲线分析能够用来确定不一样反应产物，包含非特异性产物。扩增反应完成后，经过逐步增加温度同时监测每一步荧光信号来产生溶解曲线，伴随反应中双链,DNA,变性，荧光染料又回复到游离状态造成荧光信号降低，用荧光信号改变负一次倒数与温度作图，在扩增产物溶解温度上有一特征峰（,Tm,，,DNA,双链解链,50,温度），用这个特征峰就能够将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不一样温度溶解,.,rqpcr技术的原理及临床应用,第11页,SYBR Green,法优缺点,优点,:,对,DNA,模板没有选择性,适合用于任何,DNA,使用方便,-,无须设计复杂探针,非常灵敏,廉价,rqpcr技术的原理及临床应用,第12页,2,、,TaqMan,探针法,rqpcr技术的原理及临床应用,第13页,TaqMan,作用机理,rqpcr技术的原理及临床应用,第14页,TaqMan,法优缺点,rqpcr技术的原理及临床应用,第15页,Real-time PCR,临床应用,rqpcr技术的原理及临床应用,第16页,荧光定量,PCR,在病原体检测中应用,一 肝炎病毒定量检测,二 性病病原体检测,三 结核杆菌及呼吸道病原体检测,四 优生优育,(TORCH),相关项目检测,临床应用,rqpcr技术的原理及临床应用,第17页,HBV,（二）,HBV-DNA,与“两对半”,1.“,两对半”：机体免疫反应状态；,2.“,携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能,反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR,：检测是,HBV,本身遗传物质,DNA,，是,病毒存在和复制最可靠、最直接指标。,rqpcr技术的原理及临床应用,第18页,3.,血清学指标,(,),不能排除,HBV,感染,。,HBV,（二）,HBV-DNA,与“两对半”,HBsAg(,),HBV-DNA(,),HBeAg(,),HBV-DNA(,),4.,也可能出现,HBsAg(,),，,HBV-DNA(,),。,5.HBsAb(,),、,HBcAb(,),、,HBeAb(,),三抗体阳性,与,HBV DNA 2.5,10,3,copy,/ml,结果解释。,rqpcr技术的原理及临床应用,第19页,rqpcr技术的原理及临床应用,第20页,(1)HBV,基因变异，如,S,区和前,S,区变异，可影响,HBsAg,表示或改变其抗原性；,(2)HBV-DNA,基因重排：,HBV-DNA,基因整合到宿主染色体中，可造成,DNA,序列重排，进而影响,HBsAg,表示。,(3),患者原因：患者处于,HBV,感染恢复早期，体内,HBsAg,水平很低，或患者体内存在长久低水平,HBV,复制，采取普通酶联免疫吸附试验不能检出。,(4)HBsAg,免疫复合物形成：免疫复合物中抗体封闭复合物内抗原，试剂中抗体不能与复合体内抗原结合，从而致,HBsAg,假阴性结果。,rqpcr技术的原理及临床应用,第21页,HBV,(,三,),HBV-DNA,定量检测临床意义,3.HBV-DNA,定量与预后,a.,含量高者急性肝炎患者易慢性化,b.,癌变几率显著高于含量低者,1.HBV-DNA,定量与,HBV,复制水平及传染性,2.HBV-DNA定量与乙肝药品疗效,a.教授提出10,3,copy/ml做为阴性或临床治愈标准,b.HBV-DNA定量分析与,干扰素,治疗(前、中、后),c.,拉咪呋,啶,rqpcr技术的原理及临床应用,第22页,HBV,(,三,),HBV-DNA,定量检测临床意义,4.HBV-DNA,定量有利于指导怀孕与孕期，哺乳期检验,5.,肝脏移植与,HBV-DNA,Mazzaferro,等汇报：,10,5,copy/ml,发生了严重,HBV,再感染,6.,血液制品和献血员筛选,rqpcr技术的原理及临床应用,第23页,二 常见性传输疾病病原体,一淋球菌（,NGH,）,二沙眼衣原体（,CT,）,三解脲脲原体（,UU,）,四梅毒螺旋体（,TP,）,五单纯庖疹病毒（,HSV,）,六乳头瘤病毒（,HPV,）,七人类免疫缺点病毒（,HIV,）,八,EV71 A16,通用型,rqpcr技术的原理及临床应用,第24页,1.,非培养或形态学检验诊疗技术，快速、特异、敏感。,2.,对无症状或症状轻者，能够早期确诊。,3.,对,NGH,、,CT,、,UU,等混合感染者，诊疗和判别诊疗。,4.,指导用药、考评疗效。,荧光定量,PCR,诊疗,NGH/CT/UU,意义,NGH/CT/UU,rqpcr技术的原理及临床应用,第25页,NGH/CT/UU,荧光定量,PCR,诊疗,NGH/CT/UU,意义,5.,不孕不育、优生优育。,6.,流行病学调查，为性传输疾病监控提供依据。,rqpcr技术的原理及临床应用,第26页,绝对定量：从荧光到拷贝数,rqpcr技术的原理及临床应用,第27页,标准品,rqpcr技术的原理及临床应用,第28页,标准品梯度稀释方法,rqpcr技术的原理及临床应用,第29页,