离子交换层析分离技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第 九 章 离子交换层析法,仪器设备简介,离子交换全套装置,第 九 章 离子交换层析,第一节 离子交换层析基本原理,第二节 离子交换剂的分类与性质,第三节 离子交换剂与缓冲液的选择,第四节 离子交换拄层析操作方法,第五节 离子交换拄层析应用,第一节 离子交换层析基本原理,一、离子交换剂的组成结构及其的特性,二、离子交换剂的选择性,三、离子交换柱层析原理示意图,一、离子交换剂的组成结构及其特性,基质 电荷基团 反离子,商品名,纤维素,OCH,2,COO,-,Na,+,CM-纤维素,纤维素,-O-（CH,2,）,2,-,N,+,H,（C,2,H,5,）,2,Cl,-,DEAE-纤维素,聚苯乙烯,SO,3,-,Na,+,732阳离子树脂,聚苯乙烯,N,+,（CH,2,）,4,Cl,-,717阴离子树脂,聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备,离子交换树脂的形状结构示意图,二、离子交换剂的选择性,1、平衡常数,2、选择性与离子的电荷及,水合离子半径的关系,3、离子浓度对选择性的影响,4、两性物质的选择性,1、平衡常数,值反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性，称为选择系数，此外平衡的移动遵循质量作用定律,若K,B,A,值1，即RBRA，,若K,B,A,值1，即RBRA,若K,B,A,值1，即RBRA，,RA+B,+,RB+A,+,2、选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系,离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。,一价离子：Li,+,Na,+,K,+,Rb,+,Cs,+,二价离子：Mg,2+,Ca,2+,Sr,2+,Ba,2+,一价阴离子：F,-,Cl,-,Br,-,I,-,不同价阳离子：Na,+,Ca,2+,Al,3+,Ti,4+,磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数,阳离子树脂,阴离子树脂,反离子,相对选择系数,反离子,相对选择系数,H,+,Na,+,NH,4,+,K,+,Mn,2+,Mg,2+,Fe,2+,1.0,1.5,1.95,2.5,2.35,2.5,2.55,OH,-,柠檬酸,乙酸,Cl,-,HCO,-,HPO,-,苯,1.0,220,3.2,22,6.0,5.5,500,三、离子交换柱层析原理示意图,动画按钮,第二节 离子交换剂的分类及性质,一、离子交换剂分类,二、离子交换剂性质,一、离子交换剂分类,1疏水性,2亲水性,(1)阳离子交换剂,(2)阴离子交换剂,（1）纤维素离子交换剂,（2）交联葡聚糖离子交换剂,（3）琼脂糖离子交换剂,1疏水性离子交换剂,R-SO,-,3,H+Na,+,=R-SO,3,Na+H,+,R-PO（OH）,2,+Na,+,=R-POOHONa+H,+,R-N,+,（CH,3,）,3,OH,-,+Cl,-,=R-N,+,（CH,3,）,3,Cl,-,+OH,-,R-N,+,（CH,3,）,2,OH,-,+H,2,O=R-N,+,（CH,3,）,2,HOH,-,R-N,+,（CH,3,）,2,HOH,-,+Cl,-,=R-N,+,（CH,3,）,2,HCl+OH,-,阴,离,子,交,换,剂,阳,离,子,交,换,剂,2亲水性离子交换剂,磷酸纤维素,CM-纤维素,DEAE-纤维素,CM-交联葡聚糖,DEAE-交联葡聚糖,CM-Sepharose CL-6B,二、离子交换剂性质,颜色与形状,交联度,吸水量或膨胀度,交换容量,稳定性,比重,交换容量,交换容量:,是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。,(mgg或mmolg、mgml或mmolml),交换容量的,测定,：,强酸型与强碱型测定其解离盐的能力；,弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。,影响交换容量的,因素,：,筛孔、离子强度、pH值。,强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法,取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1molL的NaOH处理，去离子水洗至中性，1molL的HCl处理，去离子水洗至中性。然后用1molL的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。,计算公式如下：,强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法,取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1molL的HCl处理，去离子水洗至中性，1molL的NaOH处理，去离子水洗至中性。然后用1molL的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如下：,凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介质换容量的测定方法,取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1molL的NaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaCl或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容量。,第三节 离子交换剂与缓冲液的选择,一、离子交换剂的选择,二、缓冲液的选择,一、离子交换剂的选择,必须考虑的影响因素,1阴、阳离子交换剂的选择,2强、弱离子交换剂的选择,3不同离子型交换剂的选择,4不同基质离子交换剂的选择,必须考虑的因素,要求,高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质,影响,因素,对样品生物活性和可溶性的影响,pH对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响,分子大小及共存物质的影响,1阴、阳离子交换剂的选择,参照电泳结果,测定pI,确定稳定pH范围,碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c,酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG,离子交换剂的选择图,2、强、弱离子交换剂的选择,3、不同离子型交换剂的选择,选用何种类型离子交换剂?,-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择,H,型和,OH,型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择,Na,型和,Cl,型。,4不同基质离子交换剂的选择,基质的理化性质,目标物质的理化性质,溶液的组成及杂质含量,二、缓冲液的选择,1、缓冲液pH的选择,2、缓冲液离子组成的选择,3、缓冲液离子强度的选择,1、缓冲液pH的选择,要求：,起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。,PH值与目标物pI的关系（pH=pI1）,选择性吸附,选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；,选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；,2、缓冲液离子组成的选择,缓冲液离子的pK值要接近所用的pH，,采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，,如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐,采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，,如：Tris,缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。,3、缓冲液离子强度的选择,起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。,洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。,第四节 离子交换拄层析操作方式,一、离子交换剂的处理、转型和再生,二、分离物质的交换,三、物质的洗脱与收集,一、离子交换剂的处理和转型,一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性,疏水性离子交换剂,用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理,亲水性离子交换剂,用0.5mol/LNa0H或0.5mol/LHCl溶液处理；,转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程,。,欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH,4,OH或NH,4,C1处理。,目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团,二、分离物质的交换,分批法,柱层析法,实际交换量只能按理论交换量的25-50计算,。,分批法,柱层析系统的组装,柱层析系统的连接,三、物质的洗脱与收集,梯度混合器及形成的,梯度变化,离子强度,梯度洗脱,pH值梯度洗脱,产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化,C=C,B,-（C,B,-C,A,）（1-V,2,/V,1,）,B1/A1,C,A,、C,B,梯度混合器A瓶、B瓶的浓度；,A1、B1 A瓶、B瓶的横切面积；,V,2,流经层析柱的体积，V,1,梯度洗脱液的总体积。,线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱,第五节 离子交换拄层析应用,一、去离子水的制备,二、制备、纯化生命物质,二、测定蛋白质的等电点,