食品安全与农产品检测

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食品平安与农产品检测,Food Safety and Analysis of,Agricultural Products,Quality Safety,1,资源环境学院,郑险峰,2,第三章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定,第一节 概述,3,一、,概述,农产品包括农作物及果蔬收获物中的各个局部，如籽粒、果实、茎叶、秸秆等。它们无论作为食物、饲料或是农产品加工的原料，都要求确知这些产品中各组分的含量。这些组分有蛋白质、氨基酸、脂肪，淀粉、糖分、水分、纤维素、有机酸类以及一些特殊的成分如维生素、单宁、大量和微量元素等等，它们含量的多少是鉴定其品质好坏的重要标志。当前要求大力开发利用农产品资源，以满足愈来愈高的社会需求。因此，对农产品进行品质分析无疑是十分需要的。,4,蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重要的成分。它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆类可达,45,一,55,，其次是花、叶、茎和根。作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组织输送，在接近成熟时期，茎叶中的氮向贮存器官输送，合成的蛋白质集中于种子中。,5,各种农产品中蛋白质的含量水平%,作物,蛋白质,（干基）,作物,蛋白质,（干基）,作物,蛋白质,（干基）,作物,蛋白质,（干基）,菜豆,洋扁豆,速豌豆,蚕豆,大豆,亚麻,向日葵,(,仁,),棉籽,(,仁,),小麦,黑麦,15.030.5,24.634.1,22.034.0,27.035.0,29.450.4,2.030.8,21.130.2,28.642.0,19.330.0,14.424.1,大麦,燕麦,稻米,玉米,小米,(,仁,),高梁,荞麦,(,仁,),10.620.4,8.017.3,7.814.5,9.013.2,10.221.5,9.515.3,12.819.0,马铃薯,冬油菜,甜菜,萝卜,胡萝卜,洋葱,大蒜,菠菜,芹菜,番茄,0.72.7,1.01.5,0.71.4,0.61.2,0.61.9,1.92.8,6.7,2.3,1.33.6,0.30.8,茄,辣椒,南瓜,黄瓜,甘蓝,花椰菜,浆果,核桃,高梁叶,高梁茎,0.61.2,0.71.1,0.41.0,0.50.9,1.22.6,2.4,0.31.9,16.128.9,12.417.5,4.07.5,6,蛋白质是生命的物质根底，它的含量是衡量农、畜、水产品品质和营养价值的重要指标。测定植物各局部中蛋白质的含量，对其品质鉴定、品种选育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋白质含量等有重要意义。也对产品加工方式及其产品质量有影响：在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。,7,氨基酸是组成蛋白质的根本单位，也是蛋白质的分解产物：全氨基酸和个别氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。生物学及农业科学的许多领域都需要分析氨基酸。在评价谷物的蛋白质营养价值时需要测定游离氨基酸及蛋白质的氨基酸组成。动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸两种。,8,在人和动物营养学上，各种氨基酸含量的上下是很重要的，特别是有几个限制性氨基酸，如称为“第一、第二限制氨基酸的赖氨酸和色氨酸，是一种必需氨基酸，即必须从食物中直接吸收，而不能由人与动物自身合成，却又对人与动物的生长发育起着重要作用的氨基酸。假设缺乏这些氨基酸，人与动物不仅不能正常发育，还会引起某些疾病，而这些氨基酸在贮存和加工的过程中极易损失破坏，因此它们的实际含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。,9,蛋白质的分析方法很多。可分为两类：一是利用蛋白质的共性，即含氮量等；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。,最常用的方法是开氏法，因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质，如果蛋白质用重金属盐等沉淀别离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，那么称为“纯蛋白质。,蛋白质的测定,10,籽粒中粗蛋白质的测定,同类种子中蛋白质的测定,(,染料结合,-DBC,法,),同类种子中蛋白质的测定,(,双缩脲法,),蛋白质的测定提纲,11,开氏法是测定全氮量的经典方法。这个方法是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。由于设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比较或将其取代。因此国际谷物化学协会(ICC)和美国分析化学家协会(AOAC)以及我国等些国家都把开氏法作为标准的分析方法。,12,但开氏法也有缺点，主要是操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高。近年已出现几种以开氏法原理为根底的全自动或半自动的开氏定氮仪，如瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的KjelFOSS自动蛋白质分析仪等。这些仪器虽然自动化程度较高，但较昂贵，目前尚不能普及。,13,籽粒中粗蛋白质的测定,H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法,方法原理 氮素是蛋白质中的主要成分，同类植物籽粒中蛋白质的含氮量根本上是固定不变的。因此，可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数，即得粗蛋白质含量。 在生产和科研工作中，为了完成大批样品的分析，需要采用快速、简易的分析方法，例如染料结合法、双缩脲法、水合茚三酮法、荧光法、红外光谱法以及测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝法和纳氏比色法。,回提纲目录,14,氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用,6.25,，这是由蛋白质平均含氮,16%,为根据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有差异，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同。,15,以定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法分解时，硝态氮的局部氨化是不可防止的，因此蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态氮化合物，用开氏分解测定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。,16,操作步骤,(1) 样品的消煮。称取烘干样品(过0.25mm筛) 0.3000 0.5000g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中，参加混合催化剂1.8g，加几滴水湿润后，加5mL浓H2SO4，小心轻摇后(最好加塞放置过夜)，盖上小漏斗，将消煮管放置在消煮炉或电炉上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损地转入100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。,17,2氮的测定。用移液管吸取澄清待测液5.00或10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空白试验和核对试验。,18,本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测定纯蛋白质的含量，那么样品应先用蛋白质沉淀剂碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200gL-1 250gL-1单宁或100gL-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得：“纯蛋白质量。,19,称样量的大小取决于样品的含氮量。假设含氮为1.05.0，称样量为0.30g，可根据含氮量的水平适当增减称样量。,在消煮过程中须经常转动开氏瓶，使喷溅在瓶壁上的样品及早回流至硫酸溶液中，特别是开始消煮后不久，会有大量气泡向上逸，不宜升温过快，以防溢出。,回提纲目录,20,方法原理 蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的NH2、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=23的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G、酸性橙12#等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质-染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的浓度染料溶液反响前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。,同类种子中蛋白质的测定,(,染料结合,-DBC,法,),回提纲目录,21,如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，那么需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质含量()对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质()含量。假设只需比较蛋白质含量的上下，如在筛选同种作物种子的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。,22,该法是间接测定种子中蛋白质的方法。方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法。有据此方法原理而设计的蛋白质分析仪。这里必须指出该法对随意混合物的样品不适用。,23,操作步骤,标准曲线制作。与样品测定的同时，取1.000 gL-1的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放人100mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为0.1、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8gL-1的染料标准溶液，用GXD-201型蛋白质分析仪测透光率(T)，并用半对数坐标纸上绘制浓度-透光率(T)值的标准曲线。如无该型号的蛋白质分析仪，也可以把剩余的染料溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色杯和482nm的波长，在721分光光度上测定吸收值(A)绘制标准曲线。,24,样品的测定。称取通过0.25mm筛子的谷物样品200700mg，放人30mL试管中，参加lmgmL-1染料溶液20mL，盖紧试管口，在水平振荡器上振荡60min，使样品和染料溶液充分反响，取反响后的浑浊液(810mL)注入离心管中，以3 000rmin的速度离心812min，至上部溶液澄清为止，以下操作步骤同标准曲线。,25,(3),回归方程。选取粗蛋白质含量从低到高,(,如小麦种子粗蛋白质含量可以从,7.0,17.0%),的同一类谷物样品,35,个左右，用开氏法测其粗蛋白质含量,(,),，并用上述方法测定各样晶的染料结合量。根据所得的结果，计算 出染料结合量与蛋白质含量,(,),之间的回归方程。,26,式中：B每克样品所结合的染料的毫克数(mgg-1)；,V参加染料溶液的总体积(mL)；,P0染料溶液的初始浓度(mgmL-1)；,P染料结合反响后剩余溶液中染料浓度(mgmL-1)；,m样品的质量(R)。,样品的蛋白质含量()。将样品的DBC值(即“B值)代入回归方程，计算样品蛋白质的含量。,27,注,在偶氮磺酸染料中，除橘黄G外，也可以使用酸性12#(Acid Orange l2#，缩写AO l2，分于量305.37)，它的分子结构与橘黄G根本相同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺酸基，即一个结合碱基的位置(橘黄G二个)，后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是橘黄G的2倍。故其更适合于在染料结合法中应用，它们在482nm左右有一个较宽的吸收峰，便于比色测定。,28,样品称样量按蛋白质含量的上下而定。水稻、小麦、大麦等可称取500mg，玉米称取700mg，大豆称取200mg，花生及鱼粉等可少一些。,染料结合反响的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反响的时间和温度等影响到测定结果，故应力求每次测定的反响条件一致，特别是测定样品与测定回归方程的样品时的反响条件一致。,回提纲目录,29,方法原理 蛋白质的肽键结构，具有类似于双缩脲的反响基团。在碱性条件下能与Cu2+生成紫红色可溶性络合物，蛋白质含肽键多时反响呈紫色，反之肽键少时，反响呈红色。这种颜色反响称为双缩脲反响(或称缩二脲反响)。,实验证明，蛋白质溶液浓度在1-15mg之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比关系。故可用此反响进行蛋白质的测定。,同类种子中蛋白质的测定,(,双缩脲法,),回提纲目录,30,本法须用开氏法作标准回归方程。经试验其与开氏法的相关性较好，适用样品广泛，如小麦、大麦、水稻、玉米和高粱等蛋白质的测定，皆能获得良好的效果，且方法快速，使用仪器设备简单，尤适用于大批品种选择用。,31,主要仪器 恒温水浴锅、离心机、721型分光光度计。,试剂 双缩脲试剂。在500mL容量瓶中依次参加以下溶液:,40gL-1CuSO4 30mL，25gL-1酒石酸钾钠100mL，再缓慢加人5molL-1 KOH30mL，用去离子水定容。使用时将此溶液与等体积透明的异丙醇混合。假设溶液中出现浑浊或沉淀，那么不宜使用。,32,操作步骤,(1)样品的测定。准确称取过60目筛的样品0.0500.100g(含蛋白质在115gL-1范围内)，放人枯燥试管中，再用移液管参加10mL双缩脲试剂，充分搅拌，于40水浴放置15min，并经常搅拌。然后过滤或用4 000rmin-1离心10min，取清液用550nm波长比色，从标准回归方程查得蛋白质含量。,33,(2),标准回归方程的测定。分别称取,0.050 0,0.120 0g,待测定谷物样品,20-30,个,(,也可用蛋白质含量差异大的样品,30,个左右,),，先用开氏法测出具蛋白质的含量，然后按上法显色并测定吸收值,A,，作出标准回归方程。,34,注,该法为美国谷物化学协会(AACC)测定谷物蛋白质的正式方法，且已有据此法原理为根底的快速测定蛋白质的自动分析仪。,一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。,本法对温度及时间的要求严格，否那么再现性不高。采用室温20-25，须于120190min内比色；40为15-70min显色稳定；而在60连续振荡条件下显色，那么反响时间缩短为5min。,离心须用6 000rmin-1，10min可得澄清液，小于4000rmin-1的效果不佳。,回提纲目录,35,氨基酸的测定,氨基酸分析方法包括测定氨基酸的总含量及测定全氨基酸中每种氨基酸的含量两个方面。测定氨基酸总量的方法与蛋白质分析有密切的关系。许多测定蛋白质含氮含量的方法如开氏定氮法及各种比色法均可用于测定氨基酸的总含量。此外，测定氨基酸总含量的方法还有氨基氮的甲醛滴定法，方法简单，快速，广泛应用于实际工作中。,36,近代开展起来的各种色谱法是分析全氨基酸的有力工具，薄层层析是60年代开展起来的分析方法，它操作简便，设备简单、层析速度快、灵敏度高，广泛应用于别离和测定氨基酸。近20年来应用气相色谱法分析氨基酸已进行了大量的工作。气相色谱法具有分析速度快、灵敏度高的特点，仪器的本钱也比氨基酸自动分析仪低。尤其是在分析氨基酸的对映异构物及超微量(ng)样品中气相色谱有特殊的作用。,37,氨基酸自动分析仪是应用最广泛的分析氨基酸的专用仪器。该仪器的根本原理仍然是离子交换柱层析。,38,氨基酸自动分析仪,39,全氨基酸和游离氨基酸的分析,谷物和饲料中赖氨酸的测定,(,染料结合法,-DBL,法,),谷物和饲料中赖氨酸的测定,(,染料结合法,-DBL,法,),氨基酸的测定提纲,40,全氨基酸和游离氨基酸的分析,(氨基酸分析仪法),方法原理 氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相(缓冲溶液)推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时(日立835-50为磺酸型Na+柱)，氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的pH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开，流出色谱柱的氨基酸再与茚三酮在100下反响生成紫色物质茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色后的氨基酸由光度计检测；,回提纲目录,41,大多数氨基酸与茚三酮均有此反 应，所形成的,DYDA,在,570nm,处有最大的吸收峰。氨基酸自动分析仪可直接给出,50g,样品中含有各种氨基酸的纳克,(ng),数。,42,二仪器,835型高速氨基酸分析仪。,真空装置。,煤气喷灯。使用硬质玻璃水解管时，使用氧气。,恒温器。110，最好用铝合金制的热处理槽。,旋转蒸发器。,水解用玻璃试管。最好用硬质玻璃制成。,均化器旋转式混合器。,43,三试剂,试剂,6moLL-1 HC1。,880mL-1甲酸。,300gL-1H2O2。,750mLL-1乙醇。,柠檬酸盐缓冲溶液和水合茚三酮溶液,44,操作步骤,(1) 全氨基酸试样的制备。, 取样。按常法粉碎的试样，精确称取含蛋白质约10mg的量，置于水解槽中，加6molL-1HCl 10mL。如果是液体试样，参加与试样等量的浓盐酸。,45, 脱气。在真空装置上安装水解管，用真空泵脱气。将旋塞(图142的A)开启数次进行脱气。脱气完后，在水解管的A处用煤气喷灯溶化，使其密封。, 水解。用110恒温器水解22h。, 去除盐酸：水解完后，把水解管开封，用旋转蒸发器去除盐酸。干涸后，用蒸馏水溶解，再次干涸(在50以下枯燥)，, 试样溶液的制备：去除盐酸的试样，溶于10mL的柠檬酸钠缓冲溶液中。,46,(2),胱氨酸及色氨酸的水解。,由于胱氨酸及色氨酸在用盐酸水解时被破坏，所以必须另行分解。, 胱氨酸。胱氨酸被过甲酸氧化成半胱酸后，用盐酸水解。,47,色氨酸。色氨酸试样要加碱水解。取含有色氨酸12mg的试样，置于聚乙烯管中，将此管封在玻璃管中。参加4.2molL-1氢氧化钠溶液100mL和硫代二甘醇0.3mL，脱气后，封管，在110下水解24h。分解物用6molL-1 HCl 7mL中和，再用pH4.2的柠檬酸缓冲溶液调整pH为4.5，定容至一定量。,48,(3) 植物性产品中游离氨基酸试样的制备。,把试样细切或粉碎，取20-50g置于乙醇中，使乙醇最终浓度为750mLL-1。通常取10mL左右，用均化器均质后，移入烧瓶中，在80下加热回流15min，然后冷却，用瓷漏斗过滤，残渣用750gL-1乙醇50mL再提取两次，滤液合并定容至250mL，放置一夜。生成沉淀时，用玻璃过滤器(G - 3)过滤或离心别离(6000 r/min，10min)，滤液用旋转蒸发器去除水分，干涸物溶于试样稀释用的缓冲溶液中。,49,(4)上机测定。具体的测定操作步骤，应根据各种不同型号的氨基酸测定仪详细说明来进行。一般需经以下几个步骤。样品的水解。试样中氨基酸浓度的估量，以日立835-50型高速氨基酸分析仪为例，上机分析的各种氨基酸浓度应在110nmol50L为宜。分析前的仪器检查，一般有水浴及反响槽的温度，泵的流速，缓冲液，茚三酮试剂以及N2气压力等仪器的各种性能检查。,50,分析程序的设定，须按仪器说明书推荐使用的分析程序操作。混合氨基酸标准样的分析。样品分析前的混合标准样的分析，以打印出混合氨基酸标准样层析图谱的各种参数。试样的分析。最后仪器分析试样，打印出全氨基酸的色谱图，以绘出各氨基酸组分的纳克数。然后计算。,回提纲目录,51,谷物和饲料中赖氨酸的测定,(,染料结合法,-DBL,法,),回提纲目录,52,赖氨酸是一种必须的氨基酸。缺乏赖氨酸，人与动物不仅不能正常发育，还会引起某些疾病。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的氨基酸，被称为第一限制氨基酸。它在谷物贮存、加工过程中，又很不稳定，易于脱去氨基、被氧化或是发生变质而损失破坏，或变成营养上的“无效。因此赖氨酸的实际含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的重要指标。,53,测定赖氨酸的方法很多，属于化学的方法有：,2,，,4,，,6,三硝基苯磺酸,(TNBS,法,),、,1-,氟,-2,，,4-,二硝基苯法,(FDNB,法、,2-,氯,-3,，,5-,二硝基吡啶法,(CNPY,法,),等。,这些方法共同缺点是操作手续繁长费时，还需要某些特殊的试剂，不适用于成批样品的分析。离子交换色谱法,(,氨基酸自动分析仪法,),仍被认为是标准法，但仪器昂贵不能普及。现介绍在国内外应用较广泛的、简便易行的赖氨酸测定法。,54,一方法原理,染料结合法可用于测定样品中蛋白质的碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。如果先将样品用丙酸酐处理，丙酸酐便将赖氨酸的,-NH,2,的酰基掩蔽，使其失去和染料结合的能力。,然后分别测定酰化前后的,DBC,值：酰化前的测定值为赖氨酸,+,组氨酸,+,精氨酸。而酰化后只是组氨酸,+,精氨酸，以上两项测定结果的差值，就可计算之赖氨酸的含量。,55,试剂,(1),磷酸盐缓冲溶液。,(2),染料溶液。称取酸性橙,12#g,，用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至,1000mL,。,(3),半饱和醋酸钠溶液。,(4),丙酸酐,(,化学纯,),。,56,操作步骤,(1) 绘制标准曲线。在样品分析的同时，分别吸取3.89molL-1染料溶液28.3、30.9、33.4、36.0、14.6、41.1、43.7、46.3、48.9mL置于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液或水定容，即得浓度为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9molL-1的染料工作溶液。吸取各工作液20.00rnL分别参加NaOAc溶液2.00mL及磷酸盐缓冲液0.20mL，充分混匀，在GXD-201型蛋白质分析仪上测定透光率。,在半对数坐标纸上，以透光率为纵坐标，染料浓度为横坐标，绘制工作曲线(也可以用磷酸盐溶液稀释50倍后，用0.5cm比色杯和482nm波长，以721型分光光度计测吸收值A，用普通直线坐标纸绘制工作曲线)。,57,(2),样品的测定。按下表称取已粉碎过,60,目筛酰化和不酰化样品各两份，准确至,0.4mg,。分别加,30,35mL,具塞玻璃的或聚四氟乙烯的试管中，标明为,A,、,B,管,(,酰化样品,),和,C,、,D,管,(,不酰化样品,),。同时应另称样品测定水分含量。,58,样品种类,称样量（,mg,）,酰化样品,不酰化样品,水 稻,麦 类,普通玉米,高赖氨酸玉米,高 梁,谷 子,大 豆,其它豆类,花生仁,向日葵子,棉 子,700,或,800,500,800,700,或,500,1000,900,180,275,300,200,125,500,或,600,400,600,400,或,500,700,700,100,175,200,150,90,59,丙酰化反响。各管分别参加160gL-1乙酸钠溶液2.00mL(籼稻加80gL-1乙酸钠溶液)，然后加丙酸酐0.20mL于A、B管中，加缓冲溶液0.20mL于C、D)管中。盖紧塞子，置于往复振荡机上振荡10min。染料结合反响。向A、B、C、D管中各参加3.89mmolL-1染料溶液20.00mL，盖紧塞子，放置振荡机上振荡1h(籼稻、豆类2h，油料种子2h或更长)，使染料结合反响到达平衡。,离心。将以上反响液在30004000rmin-1下离心10min。,测定。在GXD-201型蛋白质分析仪上测透光率T值或721型分光光度计上测吸收值A值，同上操作步骤。,60,结果计算,由测得透光率,T,或吸收值,A,，在标准曲线上查得或由回归线计算得到的剩余染料溶液的浓度,(mmolL,-1,),，样品中的赖氨酸的浓度按下公式计算：,赖氨酸,(,)=3.89-(1.11cCD)/MCD-3.89-(1.11cAB)/mABV10-3146.2100,回提纲目录,61,色氨酸的测定乙醛酸法,色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人与动物的新陈代谢中起着重要的作用，某些代谢产物对人类的大脑功能及生长发育影响很大。已经发现人类缺乏色氨酸会患瘴皮病。然而色氨酸在绝大多数谷物中含量很低，且易被氧化和光解。它已被公认为“第二限制性氨基酸。因此，不管从育种还是从营养的观点出发，色氨酸的测定都是十分重要的。,回提纲目录,62,然而，色氨酸在酸性的介质中很不稳定。长期以来，人们一直在探索一种能适用于多种材料而又简单易行的测定方法。目前提出的方法很多，归结起来有三类：,一是找出一种理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一样，且用离子交换钯层进行测定；,二是暴露具有反响活性的吲 哚环，然后与某些试剂反响生成带色化合物，进行比色测定；三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，对色氨酸进行分光光度或荧光测定。其中乙醛酸法具有简单、快速的特点。,63,方法原理,谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解现色氨酸，然后在浓硫酸存在的情况下，Fe3+可将乙酸氧化为乙醛酸，2mol色氨酸能与1mol乙醛酸缩合，产生hopkins-cole反响，生成红紫色的化合物，反响式如下：,其红紫色的强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比，其最大的吸收峰在545nm，可进行比色测定。,64,试剂,1混合显色剂。, 称取FeCl36H2O 270mg，用0.5mL溶解后，再用冰醋酸溶解稀释至1L。, 15mol-1 H2SO4。使用前12h将试剂和等体积混合，混合时防止发热，可在冰水中进行。,20.1molL-1醋酸钠缓冲溶液。称取醋酸钠16.406g于2L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，并用醋酸调节pH至7.0。,65,3木反蛋白酶溶液。称取木瓜蛋白酶400mg溶于100mL 0.1 molL-1 醋酸钠缓冲溶液中。,4色氨酸标准溶液。, 贮备液。准确称取经105枯燥2h的色氨酸20mg，加少量温水溶解后，洗入200mL棕色容量瓶中，用醋酸钠缓冲溶液稀释至刻度，浓度为100 gmL-1。, 工作液。分别吸取、5、7.5、10、15、20mL贮备液于50mL容量瓶中，用醋酸钠缓冲溶液稀释至刻，此浓度为0、10、15、20、30、40gmL-1系列色氨酸标准溶液。,66,操作步骤,称取风干磨碎过60目筛的脱脂谷物样品100mg于具塞试管中，加木瓜酶液5mL，混匀后放入65培养箱16h，另用木瓜酶液5mL作空白，在培养的第一个小时内，每隔30min摇1次。16h后取出水解液，摇匀，冷却至室温，在3000 rmin-1 离心10min。吸上清液1mL于试管中，加混合显色剂4mL，摇匀，置65培养箱中显色15min。取出冷却至室温，在最大吸收峰545nm波长比色得吸收值A。,67,标准曲线绘制。分别吸取浓度为0、10、15、20、30、40 gmL-1系列色氨酸标准溶液各1mL，于具塞试管中，各参加混合显色剂4mL同样品相同条件下显色后比色，并绘制色氨酸质量浓度gmL-1吸收值A标准曲线。,68,结果计算,色氨酸含量%= 比色查得色氨酸gmL-1510-3100/m,式中：m样品质量mg；,10-3g换算mg的系数；,5培养液总体积mL/测定时吸取待测液的体积mL。,69,注,本方法简便、快速，有一定的准确度和精密度，适用于大量样品的筛选测定。,因冰醋酸中一般含有低量的乙醛和高含量的乙醛酸，否那么不显颜色，为此可在试剂1，中参加的80mLL-1乙酸酐，可解决显色问题。,回提纲目录,70,