第三章细胞破碎

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第三章细 胞 破 碎,1,生物分离过程的一般流程,本章内容,2,常见的细胞壁结构,细胞破碎技术,包涵体的纯化方法,本章的主要内容,3,概述,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,动物细胞多分泌到细胞外培养液,植物细胞多为胞内产物,微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外,对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。,4,概述,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。,有些目标产物存在于生物体中。,尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。,脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,5,概 述,细胞破碎,（,cell rupture,）,技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。,细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。,为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。,6,3.1,细胞壁结构对破碎的影响,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。,通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。,不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,7,细菌细胞壁结构,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；,相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，,包围在细胞周围；,使细胞具有一定的形状和强度。,8,细菌细胞壁结构,破碎细菌的主要阻力是来自于,肽聚糖的网状结构，,其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。,革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。,革兰氏阴性,菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,药物名称,宿主,用途,胰岛素,大肠杆菌,治疗糖尿病,人生长激素,大肠杆菌,治疗侏儒病,-干扰素,大肠杆菌,治疗毛状细胞白血病等,9,酵母细胞壁的结构示意图,最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，,上面的是一层糖蛋白，,最外层是甘露聚糖，由,1,6,-,磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖,-,酶的复合物。,破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,10,真菌的细胞壁,真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。,不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。,与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,11,红面包霉菌,细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物,最外层,(a),是,-,和,-,葡聚糖的混合物，,第,2,层,(b),是糖蛋白的网状结构,第,3,层,(c),主要是蛋白质，,最内层,(d),主要是几丁质。,红面包霉菌细胞壁的结构示意图,12,微生物,革兰氏,阳性细菌,革兰氏,阴性细菌,酵母菌,霉菌,壁厚,20-80 nm,10-13 nm,100-300nm,100-250nm,层次,单层,多层,多层,多层,主要,组成,肽聚糖(40-90%),多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖(1-4%),肽聚糖 (5-10%),脂蛋白,脂多糖(11-22%),磷脂,蛋白质,葡聚糖(30-40%),甘露聚糖(30%),蛋白质(6-8%),脂类(8.5-13.5%),多聚糖,(80-90%),脂类,蛋白质,细胞壁的组成和结构,微生物,革兰氏,阳性细菌,革兰氏,阴性细菌,酵母菌,真菌,壁厚,20-80 nm,10-13 nm,100-300nm,100-250nm,层次,单层,多层,多层,多层,主要,组成,肽聚糖(40-90%),多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖(1-4%),肽聚糖 (5-10%),脂蛋白,脂多糖(11-22%),磷脂,蛋白质,葡聚糖(30-40%),甘露聚糖(30%),蛋白质(6-8%),脂类(8.5-13.5%),多聚糖,(80-90%),脂类,蛋白质,细胞壁的组成和结构,13,植物细胞壁的结构,对于已生长结束的植物细胞壁可分为,初生壁和次生壁两部分。,初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（,1,3m,），富有弹性。,由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链,D-,葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。,它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。,14,植物次生细胞壁,某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m以上)，常有三层组成。,在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。,因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,15,研 磨,3.2 细胞破碎技术,16,机械破碎,捣碎法,研磨法,匀浆法,超声法,物理破碎,温度差破碎法,压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂：,表面活性剂：,酸碱,酶促破碎,自溶法,外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,17,一机械法,机械破碎法又可分为,高压匀浆破碎法（homogenization）,高速珠研磨破碎法（bead grinding）,超声波破碎法（ultrasonication）,18,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。,1.,高压匀浆法,（High-pressure homogenization）,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。,19,20,高压匀浆器的种类,高压匀浆器的种类较多,：,WAB,公司的,AVP,Gaulin,31MR,型,Bran and,luebbe,公司,SHL40,型,意大利,Niro,Soavi,高压匀浆机,21,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约,-,/10MPa,为了,控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在,20,左右。,可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,22,高压匀浆法适用的范围,大规模细胞破碎的常用方法,高压匀浆法适用的范围：,酵母和大多数细菌细胞的破碎；,料液细胞浓度可以很高，20%左右。,不宜使用高压匀浆法。,易造成堵塞的团状或丝状真菌，,较小的革兰氏阳性菌，,含有包涵体的基因工程菌（因包涵体坚硬，易损伤匀浆阀）,23,升高压力有利于破碎，,减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。,在工业生产中，通常采用的压力为,55,70Mpa,。,破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同,大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，,生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。,影响高压匀浆器细胞破碎因素,24,高压匀浆法-X-挤压器,改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至,-25,至,-30,形成冰晶体，利用,500MPa,以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。,细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。,主要用于实验室中。,优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高,对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。,25,2）珠磨法 bead mill,珠磨是常用的方法,细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于,1mm,）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机,WSK卧式高效全能珠磨机,26,高速珠磨机工作原理,磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；,细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起,在出口处，旋转园盘和出口平,板之间的狭缝很小，可阻挡玻,璃小珠，使不被料液带出。,由于操作过程中会产生热量，,故磨室还装有冷却夹套，以冷,却细胞悬浮液和玻离小珠。,27,Netzsch LM-20型珠磨机,A-具有冷却夹套的圆筒形磨室,B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘,C-环形震动侠缝分离器,D-变速马达,1和2料液进出口,3和4 搅拌冷却剂进出口,5和6磨室冷却剂进出口,园盘以两种位置交错地安装在轴上，,一种处于径向，一种与轴倾斜，,径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。,由于交错的运动，提高了破碎效率。,28,3）超声波破碎,超声波破碎法（,Ultrasonication,),利用超声波振荡器发射的,15-25kHz,的超声波探头处理细胞悬浮液。,超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,29,超声波破碎的机理,JY92-II D超声波,细胞粉碎机,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（,cavitation,),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。,操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,30,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。,一般杆菌比球菌易破碎，,G-,细菌比,G+,细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。,但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,超声波破碎的有效能量利用率极低,由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但,在实验室小规模细胞破碎中常用,。,31,技术,原理,效果,成本,举例,匀浆法(孔型),须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎,剧烈,适中,细胞悬浮液大规模处理,珠磨破碎法,细胞被玻璃珠或铁珠捣碎,剧烈,便宜,细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理,超声波法,用超声波的空穴作用使细胞破碎,适中,昂贵,细胞悬浮液小规模处理,研磨法,细胞被研磨物磨碎,适中,便宜,匀浆法(片型),细胞被搅拌器劈碎,适中,适中,动物组织及动物细胞,不同机械破碎方法的比较,32,非机械破碎方法,酶溶破碎法（enzyme lysis）,化学破碎法（chemical treatment）,去垢剂破碎法（detergents）,渗透压冲击破碎法（osmotic shock）,冻融破碎法（freezing and thawing）,33,二 非机械法,非机械方法很多,1 酶解,2 化学法溶胞,3 物理法,渗透压冲击,冻结和融化,干燥法,其中酶法和化学法溶胞应用最广,。,二,34,1 酶解,（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。,1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、,-1，3-葡聚糖酶、,-1，6-葡聚糖酶、,蛋白酶、,甘露糖酶、,糖苷酶、,肽键内切酶、,壳多糖酶等,35,外加酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。,溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，,酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。,植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,36,外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,37,酶解法的特点,优点：,发生酶解的条件温和,能选择性地释放产物,胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点：,溶酶价格高，,溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶,),产物抑制的存在。,38,酶解-自溶作用,自溶作用是酶解的另一种方法，,利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶,。,在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。,自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。,缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,39,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2 化学渗透法,（,Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,40,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。,碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。,成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,41,细胞破碎常用的表面活性剂：,十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。,非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等,对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，,能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,42,能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。,有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有机溶剂,（4）EDTA螯合剂,处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。,G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca,2+,或Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca,2+,或Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,43,通用性差；,时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过,50%,；,有些化学试剂有毒。,化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度,化学渗透法特点：,缺点,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,44,3 物理法,渗透压冲击法,冻结,-,融化法,干燥法,45,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，,将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,46,2）冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约,-15,），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，,另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,47,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在,25-30,的气流中吹干；,真空干燥多用于细菌。,冷冻干燥适用于不稳定的生化物质,3）干燥法,气流干燥,真空干燥,喷雾干燥,冷冻干燥,48,49,选择破碎方法的依据：,细胞处理量；,细胞壁强度和结构,(,高聚物交联程度、种类和壁厚度,),；,目标产物对破碎条件的敏感性；,破碎程度；,目标产物的选择性释放,50,选择性释放目标产物的一般原则,仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围,当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法,当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液,pH,值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。,(2),机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。,51,破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合,化学法、酶法、机械法相结合。,酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,有机溶剂与冻融法、干燥法结合,52,破碎技术的研究方向-,与上游过程相结合,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如,pH,、,温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂,(,如青霉素,),，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；,选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；,用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,53,（ inclusion bodies IBs),3.3 基因工程包涵体的纯化,基因工程菌培养液不同表达形式的前处理,胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。,胞内表达：,胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化,胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。,不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,54,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,蛋白,产物占菌体总蛋白,外源蛋白的积累,人胰岛素,50%,形成包涵体,-丙酰胺酶,20%,在细胞间区,-人体干扰素,25%,形成包涵体,凝乳酶原,形成包涵体,牛生长激素,30%,形成包涵体,-内酰胺酶,形成间区包涵体,人胰岛素原,5%26%,形成包涵体,55,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。,包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。,高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？,蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；,蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；,蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；,表达蛋白过多，与其结合,/,诱导组分不足，不能形成溶解状态,蛋白质自身不稳定。,包涵体的构成,56,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体,的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包涵体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。,欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,57,包涵体获得几种常见的工艺路线(一),机械破碎,(高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包涵体,加变性剂溶解,除变性剂复性,58,特点:,是利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，再对包涵体溶解复性。,优点：,摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包涵体的形成对分离纯化亦有好处。,缺点:,要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,路线1 的特点,59,包涵体获得,几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得包涵体,加变性剂溶解包涵体,除变性剂复性,60,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。,优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。,缺点：细胞碎片和包涵体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。,路线2 的特点,61,包涵体获得,几种常见的工艺路线（三）,化学破碎,（加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,62,用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包涵体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。,缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,路线三：,63,1）包涵体的洗涤,细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密。,洗涤的重要性：,收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。,洗涤剂：,温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。,洗涤剂浓度,以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,64,2）目标蛋白的变性溶解,包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。,常用变性剂：,5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；,表面活性剂如1-2 SDS，,作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。,PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。,影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。,65,原理：,在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。,复性方法：,稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。,膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。,层析法：凝胶层析，高效疏水层析,3） 目标蛋白的复性,66,蛋白质复性影响因素：,变性剂浓度,目标蛋白浓度；,pH,和离子强度；,氧化还原条件。,还原剂：,二硫苏糖醇、,-,巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；,氧化剂：,氧化型谷胱甘肽,;,碱性下通空气。,67,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达：,细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%）,无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%）。,悬浮破壁,PBS,洗涤,离心,硫铵沉淀,亲和层析,阳离子交换层析,溶解,复性,亲和层析,湿菌体,发酵液,干净菌体,上清液,包涵体,纯品,活性检测,破壁液,离心,离心液,洗涤,举例：TRAIL的分离纯化,68,1. 包涵体的洗涤,粗制包涵体用 50mM磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v),洗涤2-3次；, 用含有1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤1次 (1:3 w/v)，将粘附其表面的大部,分蛋白及水溶性杂质除去；, 用6M尿素及0.5%TritonX-100 联合洗涤1次 (1:3 w/v)，去除另一些,杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%左右）；, 用SDS-PAGE电泳检测纯度。,2. 包涵体的变性溶解,洗涤后包涵体用含有30mM DTT（二硫代苏糖醇）及5mol/l盐酸胍的Tris 缓冲液 pH =8.0 (1:5 w/v)变性溶解 室温搅拌2h，95%以上的包涵体可被溶解；, 离心，13000rpm，20min 弃沉淀得到溶解液。,69,3. 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）,以含,DTT,和,ZnSO,4,的,Tris-HCl,为复性缓冲液，再添加,0.4M L-,Arg,，,尿素，,0.5M,NaCl,作为蛋白聚集抑制剂，,变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为,90min,，每次流加浓度为,150mg/L,，变性液流加次数可高达,6,次，最终浓度可达到,1mg/ml,，,4,缓慢搅拌一段时间，,对,50mM,Tris-HCl,，,300mM,NaCl,，,尿素及,0.2mM ZnSO4,混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，,超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。,70,5. 复性后纯化,复性浓缩后蛋白,金属亲和层析,吸附,洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白,洗脱： 100mmol/L咪唑,目标蛋白,纯度达95%以上（由SDS-PAGE和RP-HPLC鉴定）,收率75%,71,包涵体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,72,思考题,常用的细胞破碎方法有哪些,在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？,基因工程包涵体的纯化方法。,73,