间接免疫荧光讲

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,间接免疫荧光法,(Indirect immunofluorescence, IFA),基本原理,将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37,保温,30min,，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗,IgG,、,IgM,抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体,。,试剂与仪器,磷酸盐缓冲盐水（PBS,）：，,荧光标记的抗体溶液：以，的,PBS,进 行稀释,缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油,9,份碳 酸盐缓冲液,1,份配制,搪瓷桶三只（内有，的,PBS 1500ml,）,有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）,荧光显微镜、玻片架、滤纸、,37,温箱等。,实验步骤,滴加，的,PBS,于待检标本片上，,10min,后弃去，使标本保持一定湿度。,2.,滴加以，的,PBS,适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，,37,保温,30min,。,3.,取出玻片，置玻片架上，先用，的,PBS,冲洗后，再按顺序过，的,PBS,三缸浸泡，每缸,3-5 min,，不时振荡。,4.,取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。,5.,立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“,+”,表示：,（,-,）无荧光；（,）极弱的可疑荧光；（,+,）荧光较弱，但清楚可见；（,+,）荧光明亮；（,+ -+,）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“,+”,以上，而各种对照显示为（,）或（,-,），即可判定为阳性。,注意事项,对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过,1,：,20,，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。,2.,染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从,10 min,到数小时，一般,30 min,已足够。染色温度多采用室温（,25,左右），高于,37,可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用,0-2,的低温，延长染色时间。低温染色过夜较,3730 min,效果好的多。,3.,为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。,标本自发荧光对照：标本加,1-2,滴，的,PBS,。,荧光标记物对照：,PBS+,荧光标记物,特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。,阴性对照：阴性血清,+,荧光标记物,阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。,阳性对照：阳性血清,+,荧光标记物,如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。,4.,一般标本在高压汞灯下照射超过,3min,，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。,