免疫组化

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,细胞生物学研究方法与技术,北京大学医学部,细胞生物学系 刘羿男,Control,Treatment,Control,Treatment,免疫细胞化学技术,一、免疫细胞化学技术的概述,二、组织和细胞标本的制备,三、免疫组化常用的染色方法,一、免疫细胞化学技术的概述,免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC),又称为免疫组化(,Immunohistochemistry,，,IHC),是利用,抗原与抗体,特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的,显色剂,(荧光素、酶、金属离子、同位素),显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为,。,(一)对抗体的要求,(二)免疫组化实验中常用的抗体,(三)抗原和抗体的结合原则,一、免疫细胞化学技术的概述,(一) 对抗体的要求,对抗体的要求：特异性高和亲和力强,Santa Cruz,Sigma,Upstate,Cell signaling,BD (主要是直标抗体),FITC或TRITC标记的二抗：北京中杉生物技术公司。,WB: Western blot；IP: Immunoprecipitation; IF: Immunoflourensence;,FCM: Flow cytometry;,IHC(P): Immunohistochemistry (PFA-fixed paraffin-embedded sections);,IHC(Ac): Immunohistochemistry (Acetone fixed);,IHC(Fr): Immunohistochemistry (Frozen sections),(二)免疫组化实验中常用的抗体,单克隆抗体：,是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用,细胞融合杂交瘤,技术免疫动物制备的。,特异性强、抗体产量高。,多克隆抗体：,是将纯化后的抗原直接免疫动物从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。,特异性低，会产生抗体的交叉反应。,多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,，可减少假阴性染色机会。,Monoclonal Antibody,Polyclonal Antibody,Ab,Ag,(二)免疫组化实验中常用的抗体,(三)抗原和抗体的结合原则,抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，都不能聚合成大颗粒。,Antigen added,Antibody precipitated,Excess Ag,Excess Ab,免疫细胞化学技术,一、免疫细胞化学技术的概述,二、组织和细胞标本的制备,三、免疫组化常用的染色方法,四、多克隆抗体的制备方法,二、组织和细胞标本的制备,标本制备恰当，是免疫细胞化学成功的首要条件。,免疫组化对组织和细胞标本的要求：,保持所检标本原有的结构、形态；,在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既,不流失,也,不弥散,，更,不被隐蔽,。,各种,抗原由于其含量及特性的差异,对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。,免疫组化中常用的组织和细胞标本,一、 组织标本,(一) 石蜡切片,(二) 冰冻切片,二、 细胞标本,(三) 组织印片,(四) 细胞培养片(细胞爬片),(五) 细胞涂片,一、组织标本,(一) 石蜡切片,石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法,最大优点是组织,形态保存完好,，且能作连续切片，有利于各种染色观察；,石蜡块还能,长期存档,，可供回顾性研究。,石蜡切片的制作过程对组织内抗原的显现有一定影响，但可通过某些措施予以改善。,取材的特殊要求及注意事项,固定及常用的固定液,抗原修复,原因,方法,载玻片的处理,一、组织标本,1.取材的特殊要求及注意事项,标本新鲜：,一般在2h之内。超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。,取材部位：,除取病灶部位外，还应取病灶与正常组织的交界处，以形成自身对照。,尽可能避开坏死区：,细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察的结果。,避免挤压：,组织受挤压可使边缘部位细胞形态改变并加深非特异着色。,取材的特殊要求及注意事项,固定及常用的固定液,抗原修复,原因,方法,载玻片的处理,一、组织标本,2.固定及常用的固定液,取材后的组织需立刻投于固定剂中,固定使组织和细胞的,蛋白质凝固,，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；,具有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。,2.固定及常用的固定液,常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。,(1) 醛类 (常用多聚甲醛、戊二醛),(2) 醇类 (常用乙醇),(3) 其它 (丙酮),(1)醛类,甲醛(福尔马林)应用最广,原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。,优点：,形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。,缺点：,甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；,分子间交联,形成的网格可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露，可造成假阴性的染色结果。,注意事项：,缩短固定时间，降低固定温度(4,C,)；组织块不宜过厚。,改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液，减少固定液pH的变化。,固定后充分水洗以减少分子间交联。,切片在作免疫组化染色前，先经预处理使,抗原再现(抗原修复),。,(1)醛类,戊二醛：,穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其它固定剂联合用作免疫电镜固定液。,多聚甲醛(常用4%)：,可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。,(1)醛类,(2)醇类,最常用的醇类固定剂是乙醇,其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生,沉淀,。,优点：穿透性强、抗原性保存好。,缺点：,脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。,对蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。,(3)其它固定剂,丙酮：,对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本。,细胞爬片常用冷丙酮(-20,C,)固定。,取材的特殊要求及注意事项,固定及常用的固定液,抗原修复,原因,方法,载玻片的处理,一、组织标本,3.抗原修复原因,常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,蛋白质之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。,抗原性物质形成醛键等而被封闭了部分抗原决定簇；,要求：在染色时，需要先进行,抗原修复或暴露,，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。,(1) 化学方法,(2) 物理方法：加热方法,水浴加热法,微波照射法,高压加热法,3.抗原修复方法,(1)化学方法,主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。,胰蛋白酶：一般使用浓度为0.050.1，消化时间为37,C，1040min，,主要用于细胞内抗原的显示,；,胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%0.4，消化时间为37,C、530min，,主要用于细胞基质抗原的显示,。,例如：Laminin、CollagenIV,举例：胃蛋白酶法的抗原修复过程,石蜡切片常规脱蜡至水；,用PBS/蒸馏水清洗数次；,将2,4滴胃蛋白液加至组织切片上；,37,C孵育5,10min；,用PBS清洗数次；,继续免疫组化的其它步骤。,(2)水浴加热法,将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。,优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室。,缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。,修复液：,最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；,最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。,(3)微波照射法,将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续,l015分钟,，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。,此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构象恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，,对抗原再现效果好。,(4)高压加热法暴露抗原,将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压23min，可取得好的效果。,由于高压下受热均匀，特别适用于大批量标本的染色。,加热法的注意事项,达到规定的温度(9295,C,以上)；,维持一定的时间；,避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；,加热后必须经过室温自然冷却(11.5h)，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型。,取材的特殊要求及注意事项,固定及常用的固定液,抗原修复,原因,方法,载玻片的处理,一、组织标本,4.载玻片的处理,抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。,新载玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。,常用的粘附剂有：,APES (3-氨丙基三乙氧基硅烷),Poly-L-Lysine (多聚赖氨酸),铬明胶溶液,APES(3-aminopropyltriethoxysilane)3-氨丙基三乙氧基硅烷,现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES (v/v);,将洗净的玻片浸于此液中2030秒钟；,取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60,C烤箱烤干。,2%的APES溶液,丙酮溶液,各2030sec,Poly-L-Lysine (多聚赖氨酸),将清洁玻片浸于100,g/ml(10%w/v),的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37,C放置30min；,60,C,烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。,1,2,3,4,铬明胶溶液,试剂,：铬明矾(chrome alum) 0.25g,明胶(gelatine) 2.5g,蒸馏水 500ml,先将铬明矾溶解于40,C少量蒸馏水中，再加入,明胶及蒸馏水，可在70,C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。,用时稍加溶化，切片浸入23min，过夜晾干。,免疫组化中常用的组织和细胞标本,一、 组织标本,(一) 石蜡切片,(二) 冰冻切片,二、 细胞标本,(三) 组织印片,(四) 细胞培养片(细胞爬片),(五) 细胞涂片,(二)冰冻切片,冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。,在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。,缩短了制片时间,抗原性不受损失,组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时,要求低温、速冻。,(二)冰冻切片,1.冰冻组织块的常用方法,液氮中冰冻,：组织投入液氮中 (-196,C,)中1020sec；,干冰中加入丙酮(或异戊烷),，液体立即气化起泡，温度降至-70,C,，将组织投入。若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；,上述组织在速冻时应浸埋于OCT(,O,ptical,C,utting,T,emperature)包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。,制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，储存于-70,C,冰箱。,2.切片,供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。,载玻片也应清洁无油污，但一般,无需涂抹粘附剂,；,切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25,C,。切片厚度一般为,58,m,。,3.切片后处理,切好的冰冻切片，室温下自然晾干12h后，入4,C,丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20。,冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。,免疫组化中常用的组织和细胞标本,一、,组织标本,(一) 石蜡切片,(二) 冰冻切片,二、 细胞标本,(三) 组织印片,(四) 细胞培养片(细胞爬片),(五) 细胞涂片,(三)组织印片,将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入,冷丙酮或4%多聚甲醛,固定10min，自然干燥后染片或-20保存备用。,(四)细胞培养片(细胞爬片),贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定,(丙酮-20,C,固定1020min，4%多聚甲醛室温固定1015min),，再进行免疫染色。,盖片的处理方法同载玻片的处理，但,泡酸时间2h,即可。,为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。,细胞涂片的方法：,手涂法,将细胞浓度调节到10,6,/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。,涂片范围应小于1cm直径，以节约试剂。,涂片机涂片法,将细胞样品制成,210,56,/ml,细胞悬液，吸取50100,l,(1210,45,cells),加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。,(五)细胞涂片或甩片,免疫细胞化学技术,一、免疫细胞化学技术的概述,二、组织和细胞标本的制备,三、免疫组化常用的染色方法,根据标记物的不同分为,(一) 免疫荧光技术,(二) 免疫酶标技术,(三) 亲和组织化学技术,三、免疫组化常用的染色方法,【原理】,标记物是小分子的,荧光素,，可标记抗体或抗原；,荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；,借助于荧光显微镜进行观察。,(一)免疫荧光技术,常用的荧光素,荧光抗体的保存,免疫荧光的染色方法,(一)免疫荧光技术,1.常用的荧光素,(1)异硫氰酸荧光素 (,F,luorescein,I,so,t,hio,c,yanate, FITC),(2)四甲基异硫氰酸罗丹明 (,T,etra,m,ethyl,R,hodamine,I,so,t,hio,c,yanate, TRITC),(3)四乙基罗丹明 (RB200),(4) 碘化丙啶 (,P,ropidium,i,odide, PI),(5) Hoechst 33342、Hoechst 33258和DAPI(4,6-,D,i,a,midino-2-,p,henyl,i,ndole,，4,6-,二脒基二苯基吲哚),对抗体或其它配体分子共价标记的荧光探针,荧光素,分子量,吸收蜂nm,发射峰nm,FITC,390,495,525,PE,240,000,490-560,575,TRITC,444,550,620,RB200,580,570,595600,PI,668,493,630,Hoechst33258,624,343,480,Hoechst33324,615,343,483,DAPI,350,345,455,(1)异硫氰酸荧光素(FITC),易溶于水和乙醇。,最大吸收光谱为,490495nm,，最大发射光谱为,520530nm,呈,翠绿色,荧光，分子量 389.4。,在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与,抗体的自由氨基,形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记1520个FITC分子。,(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC),最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈,红色荧光,，分子量为444。,与蛋白质结合的方式同FITC。,(3)四乙基罗丹明(RB200),不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。,最大吸收光谱为,570nm,，最大发射光谱为,595600nm,，呈,橙红色,荧光，分子量为580。,RB200在五氯化磷(PCl,5,)作用下转变成磺酰氯(SO,2,Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的,赖氨酸,-氨基,反应而标记在蛋白分子上。,(4)碘化丙啶(PI),是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的细胞核对比染色。,PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，无碱基特异性。,PI不能进入活细胞中，因此可用来检测死细胞。,最大吸收光谱是,493nm,，最大发射光谱是,630nm,，呈,红色,荧光。,(5) Hoechst 33342、Hoechst 33258和DAPI,HO33342、HO33258和DAPI都是DNA特异的荧光染料，与DNA结合是非嵌入式的，主要结合在A-T碱基区。,激发光谱为,343nm,，发射光谱为,483nm,(蓝色荧光)。,一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。,一般认为,04,C可保存12年，-20,C可保存34年。,要小量分装，防止反复冻融。,保存前需加防腐剂 (浓度为1:500010000的硫柳汞或1:10005000叠氮化钠)。,2.荧光抗体的保存,免疫荧光染色法常用的方法,直接法,间接法,3.免疫荧光的染色方法,【原理】,：将,荧光素,标记在相应的,抗体,上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。,(1)直接法,F,Ag,FITC-Ab,直接法,F,标本的处理：,细胞爬片、细胞涂片,先用PBS漂洗三次，每次5min；然后用4%的多聚甲醛或冷丙酮固定10min ；,石蜡切片,经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复；,若检测细胞内的抗原需要PBS-T(含0.1,0.5,Triton-X100),室温打孔,15min,；,直接免疫荧光法的操作步骤,抗体染色：,在标本片上滴加,适当稀释度,的荧光标记抗体,(1:10/1:20),，放在湿盒中，37,C或室温避光,孵育60min；,PBS漂洗三次，每次5min；,核复染(1,g/ml Hoechst,) 5min;,直接免疫荧光法的操作步骤,PBS漂洗三次，每次5min；,缓冲甘油封片,分析纯无荧光的甘油+ 0.01mol/L PBS按9:1配制。,荧光显微镜检测结果,直接免疫荧光法的操作步骤,湿盒,优点：,方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。,缺点：,敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。,直接免疫荧光法的优缺点,直接免疫荧光法的注意事项,荧光标记抗体的稀释：要保证抗体的蛋白质有一定的浓度；,一般稀释度,不应超过1:20,，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。,直接免疫荧光法的注意事项,染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；,染色时间,：一般30,60min；,染色温度,：多采用室温，37,C染色,可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0,4,C,的低温，延长染色时间。,直接免疫荧光法的注意事项,试验时需设置下列对照：,自发荧光对照(空白对照),：加PBS代替一抗。,同型对照,阳性对照,：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。,特异性对照,(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体(可省略)。,直接免疫荧光法的注意事项,一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；,经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。,需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。,可用来检测标本中,未知抗原,，也可检测血清中,未知抗体,。,待检Ag,间接法,待检Ab,F,F,(2)间接法(荧光抗抗体法),石蜡切片免疫荧光的操作步骤,二甲苯脱蜡,三次，每次5min；,梯度酒精脱水,；,PBS漂洗三次,，每次5min；,抗原修复,：枸橼酸盐煮沸10,15min (95)，自然冷却；,PBST(0.2Triton-X100)室温打孔10,15min；若检测细胞表面抗原，此步可省略；,石蜡切片免疫荧光的操作步骤,2BSA或正常羊血清室温封闭30,60min (1:20)；,加PBS或2的BSA稀释的一抗(1:100)，室温孵育1.5h或4过夜；,PBST洗3次，每次5min；,加入TRITC/FITC标记的,羊抗鼠/兔IgG,(1:100)，室温孵育30,60min (不超过1h)；,石蜡切片免疫荧光的操作步骤,PBS漂洗三次，每次5min；,用Hoechst33342(1,g/ml)复染细胞核5min；,用甘油:PBS (9:1)封片，或用带有DAPI的封片剂封片(前面步骤可以省略)；,荧光显微镜下观察结果。,冰冻切片免疫荧光的操作步骤,冰冻切片室温4的多聚甲醛或冷丙酮固定10min；,PBS漂洗三次，每次5min；,PBST(0.2Triton-X100)室温打孔15min；若进行细胞表面染色，此步可省略；,2BSA或正常的羊血清37,C封闭60min或4,C过夜；,加一抗37,C 60min或4,C 过夜；,PBS(PBST)漂洗三次，每次5min；,冰冻切片免疫荧光的操作步骤,加荧光素标记的二抗(1:100)，37,C 30,60min；,PBS漂洗三次，每次5min；,用1,g/ml Hoechst33342进行核复染色，5min；,PBS漂洗三次，每次5min；,缓冲甘油封片；,荧光显微镜下观察结果。,优点：,敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；,缺点：,参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。,间接法的优缺点,间接免疫荧光法的注意事项,若不立即观察，可放-20保存。,每次试验时 ，需设置以下三种对照：,空白对照：用PBS代替一抗,同型对照,阳性对照,间接免疫荧光法的注意事项,标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。,一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色(可用,特制的蜡笔,限定染色范围)。,细胞质-FITC,细胞核-DAPI,Identification of differentiated cardiomyocytes by Immunofluoresence with antibody against,-actinin,Exp,Control,-actinin,Hoechst,Merge,X400,X200,-actinin,Hoechst,Merge,Identification of differentiated cardiomyocytes by Immunofluoresence with antibody against,-actinin,-actinin,Hoechst,Merge,X200,X200,根据标记物的不同分为,(一) 免疫荧光技术,(二) 免疫酶标技术,(三) 亲和组织化学技术,三、免疫组化常用的染色方法,(二) 免疫酶标技术,【原理】,通过化学方法将,酶与抗体,结合形成酶标记物，或者通过免疫学方法将,酶与抗酶抗体,结合。,酶在遇到相应的底物时，经催化反应形成,有色的产物,。酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。,若生成的产物为可溶性，可用酶标仪定量(ELISA);,若生成的产物为不溶性沉淀物，可用光学显微镜进行定位研究。,酶的选择,常用的酶类及其显色底物,免疫酶标染色方法,(二) 免疫酶标技术,1.酶的选择,酶催化底物所形成的产物必需是,特异的、易被显示,；,所形成的,沉淀物必须稳定,、不扩散，以免影响组织学定位；,酶应当是比较纯的制品，在中性溶液内稳定；,酶与抗体结合时，不影响二者的活性；,在被检组织中，无内源性酶的存在。,2.常用的酶类及其显色底物,(1) 辣根过氧化物酶 (,H,orse,r,adish,p,eroxidase, HRP)及底物,(2) 碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, AP)及底物,(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物,HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由,无色的酶蛋白,和,深棕色的铁叶琳,结合而成，分子量约40kDa，等电点在5.5,9.0,之间，稳定性好；,HRP与其它酶相比，具有以下优点,标记方法简单,酶及酶标记物比较稳定，容易保存,价格较低，商品化酶易于获得,底物种类多，可根据实验目的和具体实验条件进行选择,HRP的底物：过氧化物和供氢体(DH,2,),过氧化物：,常用过氧化氢和过氧化氢尿素。,供氢体：,多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料。供氢体的种类很多，可根据具体情况进行选择,。,(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物,HRP常用的供氢体,供氢体,反应产物,染 色 溶解度,邻苯二胺(OPD),深橘黄色,大,3、3,、5、5,四甲基联苯胺(TMB),蓝绿色,大,二氨基联苯胺(DAB),棕色,不溶解,邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)在ELISA中最常用,OPD需避光保存,，工作液常在数小时内自然产生黄色，应现用现配。反应产物为,黄色,。用酸终止反应后仍为黄色。在492nm波长处有最大吸收。,TMB对光敏感性差,，应用液可放置较长时间，反应产物为,蓝绿色,。用酸终止后变为金黄色。在450nm波长处有最大吸收。,HRP常用的供氢体,DAB在组织切片中常用,DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。,目前已经有商品化的试剂盒，非常方便。,HRP常用的供氢体,(2)碱性磷酸酶(AP)及底物,AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：,偶氮偶联反应,：底物为,-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如,坚牢蓝,(fast blue)或,坚牢红,(fast red)形成不溶性沉淀，分别,呈兰色或红色。,靛蓝-四唑反应,：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成,不溶性紫兰色沉淀,。,又分为以下两种方法,(1) 酶标抗体法,直接法,间接法,(2) 非标记抗体酶法,酶桥法,PAP法,3.免疫酶标染色方法,(1) 酶标抗体法,通过,共价键将酶结合在抗体,上，制成酶标抗体，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。,优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。,缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。,(1) 酶标抗体法直接法,将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。,Ab-HRP,直接法,(1)酶标抗体法间接法,将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。,Ab2-HRP,Ab1,间接法,酶标抗体间接法的操作步骤,标本准备：,石蜡切片,脱蜡至水；,冰冻切片浸入4,C,丙酮固定10min，PBST漂洗，5min3/次；,细胞爬片先用PBS漂洗，然后4,C,丙酮固定10min；再PBST漂洗，5min3/次；,石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；,酶标抗体间接法的操作步骤,封闭内源性过氧化物酶：3H,2,O,2,-甲醇溶液室温孵育5,10min (湿盒内) ；,0.01M PBST漂洗，5min3/次；,2的BSA或正常山羊血清封闭，室温孵育30min (湿盒内) ；,倾去血清勿洗，加稀释的一抗，37,C或室温孵育60min 或4,C过夜(湿盒内)；,PBST漂洗，5min3；,加HRP标记的二抗，室温孵育lh或37,C 30min ；,加0.01H,2,O,2,0.05DAB显色 (显色液应新鲜配置)；,经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。,酶标抗体间接法的操作步骤,(2)非标记抗体酶法酶桥法,首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；,以二抗作桥，将抗酶抗体间接联结在一抗上；,再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布。,一抗,二抗(桥抗体),抗酶抗体,几点说明,一抗(假设来自种属A)的,稀释度可大些,，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。,二抗,桥抗体,(抗种属A的IgG抗体),应过量,，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。,因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合。,兔,抗X的抗体,加入桥抗体,（过量）,加入,兔,抗HRP,加HRP,酶桥法,1,2,3,4,(2)非标记抗体酶法：,优点,任何抗体均未被酶标记。,酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。,但抗酶抗体不易纯化。,(2) 非标记抗体酶法PAP法,与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;,PAP是离体制备的复合物(HRP-抗HRP)。,显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。,兔抗X抗体,加入桥抗体,（过量）,加PAP复合物,PAP法,1,2,3,PAP法评价,PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。,缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。,由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。,根据标记物的不同分为,(一) 免疫荧光技术,(二) 免疫酶标技术,(三) 亲和组织化学技术,三、免疫组化常用的染色方法,(三) 亲和组织化学法,是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。,这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。,生物素抗生物素染色法,【原理】,生物素(,b,iotin),又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。,抗生物素(,a,vidin),，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，,比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。,由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。,两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。,该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。,生物素抗生物素染色法,(1)标记抗生物素生物素法(,labelled avidin-biotin method, LAB,)：分为直接法和间接法。,直接法,用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应,。,抗,间接法用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。,(2)桥抗生物素一生物素法(,br,idge,a,vidin-,b,iotin method，BRAB),此法是用生物素分别标记抗体和酶，以,抗生物素为桥,，把二者连接起来，进行呈色反应。,(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC法),ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。,ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。,分为直接法和间接法。,直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；,间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。,直接法,ABC复合物,生物素标记,的二抗,ABC间接法,显色,底物,ABC法的评价,敏感性强,：ABC法比PAP法敏感性高2040倍。,特异性强,，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。,方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。,由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。,人乳腺癌组织石蜡切片的过氧化物酶染色,左为 低倍 右为高倍,免疫细胞化学技术,一、免疫细胞化学技术的概述,二、组织和细胞标本的制备,三、免疫组化常用的染色方法,四、多克隆抗体的制备方法,(一) 抗原(Antigen),(二) 载体(Carrier),(三) 抗体 (Antibody),四、多克隆抗体的制备方法,(一),抗原(Antibody),对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。,高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。,能刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物特异性结合的物质称为抗原。,抗原具有两个特性，即免疫原性和反应原性。,免疫原性：,引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；,免疫反应性：,能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异性结合或反应的特性。,(一) 抗原(Antibody),根据抗原是否显示免疫原性分为：,完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。,免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。,半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。,半抗原必需与,载体,结合，才能获得免疫原性。,(一) 抗原(Antibody),(二) 载体(Carrier),是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。,常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。,用,戊二醛,或,碳化二亚胺,作为交联剂通过其功能基团-NH,2,、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。,实例：,周柔丽老师实验室的工作,针对EC2的一段10肽序列制备了pAb,(三) 抗体 (Antibody, Ab),机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌的一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。,抗体主要存在于,血清,内；,抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。,免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。,IgG、IgD、IgE及血清型IgA分子均为单体分子；,分泌型IgA为双聚体，IgM为五聚体，呈星型。,人,的,各,种,Ig,结,构,的,模,式,图,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,(1) 动物的选择,选择什么动物来免疫取决于：,所需抗血清的量：,小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。,能供免疫用的抗原量：,小鼠50,g足够，而山羊需要几毫克。,动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。,常用的动物有兔、羊、马、猪等；其中雄性新西兰兔最为常用(选择年轻，健壮，体重在2.5kg左右)。,(1) 动物的选择,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。,最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:,弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant),弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant),(2) 佐剂 (A,djuvant,),是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常5:1。,两者混合后，高压灭菌保存。用时加热融化，冷却至50左右使用；,使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。,弗氏不完全佐剂(,Freunds incomplete adjuvant, FIA,),在弗氏不完全佐剂中加入卡介苗(终浓度为220mg/ml)，即成为FCA。,卡介苗可100灭活10min处理。,免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。,一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。,弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA),研磨法：适于制备大量的佐剂抗原,先将不完全佐剂加热，然后放入无菌玻璃研钵内；缓缓滴入卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。,按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。,缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。,佐剂与抗原乳化的方法,注射器混合法,将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。,优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。,缺点：不易乳化，时间长。,佐剂与抗原乳化的方法,超声波粉碎法：是一种快速乳化方法,将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下,0.5cm,，离瓶底,0.5cm,左右，以免打碎离心管。,每次乳化,1015s,，然后置冰箱,lmin,左右。反复乳化,34,次即可完全乳化。管内残余量,800rpm, 510min,收集。,优点：简单、快速、节省材料。,佐剂与抗原乳化的方法,判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。,乳化好的标志,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法免疫途径,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。,一般采用多点注射方法,常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。,(3) 免疫方法免疫途径,几点说明：,大动物一般不用腹腔注射,抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100,g抗原即可获得较好的免疫效果。,皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。,(3) 免疫方法免疫途径,(3) 免疫方法次数及间隔时间,次数一般为23次(初次免疫和加强免疫),间隔时间: 一般而言，动物越大，间隔越长。,豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；,第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。,抗原剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。,举例1：家兔的免疫,初次免疫,用,50,200,g Ag,加入FCA，在背部皮下注射,6,8,点，每点,0.1,0.2ml,，也可肌肉内或皮内注射；,两周后，加强免疫,将,50,200,g Ag,溶于,PBS,或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；,抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血,抗体效价在10,5,以上或,1:16,以上，即可采血，取血清进一步提纯。,举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔,一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔,先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔 5mg)；,10天后，见腋窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；,以后每隔两周用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2550,g；,兔耳放血进行抗体效价检测。,举例3：豚鼠和大鼠的免疫,初次免疫,用,10,100,g Ag,加入FCA，在背部皮内注射,4,6,点，每点,0.lml,，也可肌肉内或皮下注射；,加强免疫,每隔,7,8,天，将,10,50,g Ag,于,PBS,或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；,抗体效价的检测,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；,免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。,(4) 免疫剂量,各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量,动物的种类,首次剂量,加强剂量,家兔,豚鼠和大鼠,小鼠,鸡,绵羊或山羊,50200,g,10100,g,550,g,50200,g,0.510mg,50200,g,1050,g,550,g,50200,g,0.510mg,(4) 免疫剂量,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,免疫双向扩散法,指抗原和抗体在同一凝胶内扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线(白色弧状沉淀线),优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。,(5) 抗体效价的检测,免疫双向扩散法的操作步骤,将玻璃板或载玻片用水洗净，再用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用；,将l agar 融化后，置56,C水浴,铺胶，厚度约1.5mm。胶凝固后打孔(直径3mm)，孔间距10mm。,中央孔加5,l 抗原样品，周围孔内加5,l倍比稀释的抗血清( 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。,凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。,观察结果。,(5) 抗体效价的检测,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),使抗原结合到某种固相载体表面；,使酶标的抗体与抗原特异性结合；,加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，根据颜色反应的深浅来进行定量。,(5) 抗体效价的检测,ELISA法测定抗体效价实例,ELISA,包被液稀释纯化的抗原，然后包被,96,孔板，,100,l/,孔，,浓度为,5,g/ml，,4,过夜；,弃去包被液，用,0.05% Tween20/PBS,漂洗,3,次；,3%BSA/PBS,室温封闭,2h,或,4,过夜；,0.05% Tween20/PBS,漂洗,3,次；,向各孔分别加入不同稀释度的抗血清(1:10,1:10,2, 1:10,3,1:10,4, 1:10,5,)和免疫前血清，每个稀释度设,3,个复孔，,50,l/,孔，室温孵育,1h,；,(5) 抗体效价的检测,0.05% Tween20/PBS,漂洗,3,次,加入辣根过氧化物酶,(HRP),标记的羊抗兔,IgG,，,50,l/,孔，室温孵育,1h,；,0.05% Tween20/PBS,漂洗,3,次；,加,OPD(,邻苯二胺)底物反应液，,100,l/,孔，避光显色,1015min,后，加入,50,l/,孔反应终止液；,ELISA READER,测定,OD,492,nm,吸光度值。,P/N= (标本A值-空白A值) / (阴性对照A值-空白A值),以P/N2.1为抗体反应阳性。,(5) 抗体效价的检测,动物的选择,佐剂(,adjuvant,),免疫方法,免疫剂量,抗体效价的测定,抗体的纯化,(四)多克隆抗体的制备,抗体纯化的方法很多，亲和层析(affinity chromatography)是抗体纯化的最有效的方法之一。,原理：亲和层析是利用生物分子与固相介质中的配基发生特异性可逆结合而形成的层析分离技术。,在一定的条件下，抗体结合在柱子上，然后改变实验条件，使抗体从柱子上解脱下来。,(6) 抗体的纯化,优点：,具有高效、快速、纯化结果好,缺点：,需要高纯度的亲和偶联配体；,洗脱液可能损害抗体的活性；,配体可能从柱子上掉下,来；,成本高，费用大,。,(6) 抗体的纯化,常用的配体有3类：Protein A,亲和层析；Protein,G,亲和层析；,抗原,。,Protein A是金黄色葡萄球菌的表面蛋白，对IgG具有高亲和力和特异性。,Protein G是链球菌的细胞表面蛋白，结合在IgG的Fc区域。,有的动物的某些IgG不与Protein A结合，而与Protein G结合；,Protein G比Protein A的亲和力强、亲和性广泛。,(6) 抗体的纯化,