临床基因扩增检验质量保证205新版讲课

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床基因扩增检验质量保证,湖北省临床检验中心,黄 鹏,临床基因扩增检验实验室常规测定可大概分为：,1、样本收集,2、样本处理（核酸提取）,3、核酸扩增,4、产物检测,5、结果报告,6、报告解释,临床基因扩增检验各项步骤及其与质量保证的关系,IQC,EQA,QA,患者,标,本,收,集,选择测定项目,患者准备,标本采集,标本保存,实,验,室,标本接收,贴标签,标本测定,测定的有效性,报,告,和,解,释,报告发出,结果解释,结果管理,标本收集、运送、保存及其质量控制,室内质量控制（IQC）,IQC主要包括三个方面：,测定前的质量控制；,分析中的质量控制；,分析后的质量控制。,一、测定前的质量控制,（一）实验室设施、仪器设备及管理,1、合理的空间： 仪器设备、实验台放置空间；,实验操作人员的活动空间。,舒适的心情！,2、设 备： 保养良好；,3、实验用品： 达到相应要求。,例如：加样器、带滤芯吸头、高速冷冻离心机、热循环仪、扩增仪、酶标仪、,洗板机、生物安全柜、冰箱、空调、可移动紫外灯、振动器等。,表1 基因扩增检验仪器设备的质控,仪器设备,质控方法,频 度,失 控 标 准,扩增仪,仪器校验实验,当仪器移动时,实验失败,热电偶监测温度,每月一次,如靶温度或温度差异超出允许范围,扩增功能检测,每4个月一次,程序打印,每次测定时,待测孔未出现扩增，检测温度打印程序不对,加样器,校准,每年2次,不符合要求,水浴箱,温度检测,每次实验,不符合要求,酶标仪,预防性维护及校准,每年2次,不符合要求,（二）理想的试剂和操作方法,1、试剂盒：每批质检和评价；,2、理想的操作方法：条件变化不大、测定结果影响最小。,质检包括两个方面：,一是看：是否污染，即是否有假阳性存在。,二是看：使用弱阳性质控物检测试剂的扩增检测效果。,国家级参考实验室采用相同及不同厂家试剂检测结果一览表,包装批号,试剂,对数值,定值范围,1104,进口A,4.57E3 (3.66),1.45E31.45E4 (3.164.16),1104,进口A,4.43E3 (3.65),1.40E31.40E4 (3.154.15),1104,国产B,1.04E3（3.01）,3.27E23.27E3 (2.513.51),二、分析中质量控制,（一）理想的室内质控样本的条件,1、基质与待测标本一致: 不同的基质可能含有不同的抑制物。,2、待测物浓度应接近试验的决定性水平,定性测定：测定的阳性判断值（cut-off）；,定量测定：方法测定浓度范围的下限和上限。,待测物浓度接近试验决定性水平的室内质控物，能最灵敏地反映测定的变异。,3、有很好的稳定性。,4、靶值或预期结果已定。,5、无已知的生物传染危险性。,6、单批可大量获得。,（二）测定中质控样本的设置、数量及排列顺序,定性测定：一份弱阳性（接近cut-off ）、一份阴性质控,样本。,定量测定：采用高、中、低三种浓度的质控样本。,排列顺序：标准品或校准品之后，临床样本之前。,（三）统计质控方法,1、基线测定：,最佳条件下的变异（OCV）：均值（x）、s和变异系,数（OCV）。所有测定数据不管其是否超出3s，均应用于,上述统计计算。,常规条件下的变异（RCV）：均值（x）、s和变异系,数（RCV）。所有测定数据不管其是否超出3s，均应用于,上述统计计算。,当OCV RCV 2OCV时，RCV可接受，否则，就需要,对常规条件下的操作水平采取措施予以改进。,在进行基线测定时，既可使用质控样本扩增后的IU/ml,来进行统计计算，也可用其对数值进行。,表2 常用质控规则的符号及定义,定 义,12S,一个质控测定值超出 x 2 s控制限。,13S,一个质控测定值超出 x 3s控制限。,22S,两个连续的质控测定值同时超出 x+2s或 x-2s控制限。,R4S,同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。,31S,三个连续的质控测定值同时超出 x+1s或 x-1s控制限。,41S,四个连续的质控测定值同时超出 x+1s或 x-1s控制限。,7X,七个连续的质控测定值同时处于均值（ x ）的同一侧。,7T,七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。,8X,八个连续的质控测定值同时处于均值（ x ）的同一侧。,9X,九个连续的质控测定值同时处于均值（ x ）的同一侧。,10X,十个连续的质控测定值同时处于均值（ x ）的同一侧。,2、Levey-Jennings质控图方法的基本特点,根据RCV计算中的平均值和SD确定质控限，一般以,x2 s为告警限，x3 s为失控限；, x2 s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接,受；,以x3s为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力,不强。,举例,Levey-Jennings质控图的使用及分析方法。,表3为一组HBV DNA室内质控血清（含量为2.0104 IU/ML ）,的测定数据，绘制的质控图如图2所示。,图2 Levey-Jennings质控图,0 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20,+3SD,+2SD,+1SD,-1SD,-2SD,-3SD,测定批（次）,表3 HBV DNA定量PCR测定室内质控数据,测 定 批,测 定 结 果,测 定 批,测 定 结 果,原始数据,原始数据,（ IU/ML） 对数值,（ IU/ML ） 对数值,基线测定均值,2.3104,标准差(s),6.9104,14,1.6104 4.20,1,1.8104 4.26,15,1.5104 4.18,2,3.4104 4.53,16,1.1104 4.04,3,2.0104 4.30,17,1.7104 4.23,4,3.0104 4.48,18,1.0104 4.00,5,1.7104 4.23,19,1.5104 4.18,6,2.6104 4.41,20,3.6104 4.56,7,3.2104 4.51,21,1.3104 4.11,8,1.9104 4.28,22,4.5104 4.65,9,2.6104 4.41,23,1.2104 4.08,10,1.6104 4.20,24,4.0104 4.60,11,2.9104 4.46,25,1.7104 4.23,12,2.2104 4.34,26,4.1104 4.61,13,1.9104 4.28,27,5.3104 4.72,0 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27,4.37104+3SD,3.68104+2SD,2.99104+1SD,2.3104 ,1.61104-1SD,0.92104-2SD,0.23104-3SD,测定批（次）,图3 根据表4数据得到的Levey-Jennings质控图,第1-13批，为正常的波动；第14-19批，可能存在准确性问题，有系统误差存在；第20-第27批，波动幅度过大，精密度不好，存在随机误差，第27批结果甚至超出了3s，处于失控状态。,3、累积和（CUSUM）质控方法,累积和（CUSUM）质控方法于1977年由Westgard等提,出，对系统误差有较好的测出能力。,质控规则是以均值（ x ）和标准差（s）为基础确定，常,用质控规则及其含义，如表5所示。,表4 常用的累积和（CUSUM）质控规则,质控规则,起动累积和计算的阈值（k）,质控限（h）,CS,1.0S,2.7S,1.0S,3.0S,CS,CS,0.5S,5.1S,X1.0S,X1.0S,X0.5S,2.7S,3.0S,5.1S,具体质控步骤如下：,先求测定均值（x）和标准差（s）；,计算阈值（k）和质控限（h）；,确定质控规则；,绘制质控图；,累积和计算。,判断是否失控，采取措施予以纠正。,下面以使用质控规则 举例说明。,CS,1.0S,2.7S,根据在不同时间10次（批）测定HBV DNA （含量为3.0104IU/ml）质控血清所得的均值及标准差为：,X =2.5104 S =0.5 104,ku =3.0104 （ ku=x + 1.0s ）,kl =2.0104 （ Kl=x - 1.0s ）,h = 1.35 104 （ h= 2.7s ）,阈值（k）和质控限（h）；,X+2.7s(hu) hu=3.85 104 （hu=x + h）,X+1.0s(Ku) ku上限=3.0104 （ku=x + 1.0s）,X X =2.5104 S =0.5 104,X-1.0s(Kl) kl下限=2.0104 （Kl=x - 1.0s）,X-2.7s(hl) hl=1.15 104 （hl=x - h）,图4 累积和质控图,质控限h=1.35104 （h= 2.7s）,说明：,di： 为第i批质控测定值与k值之差；,CSi： 为第i批质控测定时的累积和；,ku和kl： 分别为阈值上限和阈值下限，当质控物测定值超出k值时，即开始累积和计算。,表5 HBV DNA定量PCR测定累积和（CUSUM）质控,测定批,测定值,*104,di,*104,Csi,*104,结果解释,测定批,测定值,*104,di,*104,Csi,*104,结果解释,1,2.8,11,1.5,-0.5,-0.7,2,2.1,12,2.8,0.8,0.1,停止累积和计算,3,2.6,13,2.3,4,3.3,0.3,0.3,起始累积和计算,14,2.9,5,3.6,0.6,0.9,15,3.8,0.8,0.8,起始累积和计算,6,3.1,0.1,1.0,16,3.4,0.4,1.2,7,1.9,-1.1,-0.1,停止累积和计算,17,1.9,-1.1,0.1,8,2.9,18,3.8,0.8,0.9,9,2.1,19,3.3,0.3,1.2,10,1.8,-0.2,-0.2,起始累积和计算,20,3.6,0.6,1.8,失控,（X =2.5104, s=0.5104, ku上限=3.0104, k1下限=2.0104, 质控限h=1.35104),4、即刻法质控的计算及评价方法,1）依据：美国CLIA88关于临床实验室（定量测,定）室内质控工作指南。,2）适用于：,不是每天开展且标本量少的项目；,试剂盒有效期较短；,各级各类医院实验室，特别是基层卫生院。,3）方法：只需连续测定3次，即可对第三次检验结果进,行检验和控制。,A、 从测定值中，找出 最大值和最小值；,B、 计算测定均值 和s。,C、计算SI上限值和SI下限值，见公式,SI上限= （ 最大值）/ s ；,SI下限= （ 最小值）/ s,D、 将SI上限、SI下限值与SI值表中的数字比较。,n,n3s,n2s,n,n3s,n2s,3,1.15,1.15,12,2.55,2.55,4,1.15,1.15,13,2.61,2.61,5,1.49,1.49,14,2.33,2.33,6,1.46,1.46,15,2.66,2.66,7,1.75,1.75,16,2.37,2.37,8,2.22,2.22,17,2.71,2.71,9,2.03,2.03,18,2.82,2.82,10,2.32,2.32,19,2.50,2.50,11,2.11,2.11,20,2.85,2.85,当SI上限值和SI下限值n2s时，表示在控；,当SI上限和SI下限有一值处于n2s和n3s值之间时，,处于“告警”状态；,当SI上限值和SI下限值n3s时，说明该值已在3s范,围之外，属“失控”。,当检测的数字超过20次以后，可转入使用常规质控,方法进行质控。,即刻法质控原始数据记录表（资料参考）,日期,次数,n,n 2s,n 3s,S/CO,x,s,SI上,限 值,SI 下,限 值,结果,1/4,1,1,1.71,2/4,2,2,1.81,3/4,3,3,1.15,1.15,1.90,1.81,0.10,0.9,1.0,4/4,4,4,1.49,1.46,1.81,1.81,0.08,1.13,1.25,7/4,5,5,1.75,1.67,1.09,1.66,0.33,0.73,1.73,7/4,6,5,1.75,1.67,2.10,1.87,0.15,1.53,1.07,8/4,7,6,1.94,1.82,1.43,1.79,0.22,1.41,1.64,9/4,8,7,2.10,1.94,1.62,1.77,0.21,1.57,1.62,10/4,9,8,2.22,2.03,2.14,1.82,0.24,1.35,1.60,11/4,10,9,2.32,2.11,1.43,1.77,0.26,1.42,1.62,日期,次数,n,n 2s,n 3s,S/CO,x,s,SI上,限值,SI下,限值,结,果,14,11,10,2.41,2.18,1.90,1.78,0.24,1.50,1.79,15,12,11,2.48,2.23,1.35,1.74,0.27,1.48,1.59,16,13,12,2.55,2.29,2.00,1.77,0.26,1.42,1.62,17,14,13,2.61,2.33,1.52,1.75,0.26,1.50,1.54,18,15,14,2.66,2.37,1.71,1.74,0.25,1.60,1.56,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,24,19,18,2.82,2.50,2.00,1.77,0.25,1.48,1.68,25,20,19,2.85,2.53,1.43,1.75,0.26,1.50,1.54,28,21,20,2.88,2.56,1.52,1.76,0.25,1.52,1.64,20次在控数据测定为：,X = 1.76 s=0.25 cv= 14.2%,说明：,1、S为样本测定OD值，CO为Cut-off值，X为均值，s为标准差。,2、结果在控以“”表示；失控“ ”表示。,3、失控数据及原因要填写“室内质控失控报告单”。,4、当获取20个在控数据以后，可将X = 1.76作为常用靶值，s=0.25作为常用控制限作图。质控规则主要采用2S、3S规则。,5、具体作图方法参照全国临床检验操作规程（第二版）P316页。,绘制质控图（利用20次在控数据作X-S图） X = 1.76 s=0.25 cv%= 14.2%,1.76,1.51,1.26,1.01,2.01,2.26,2.51,次数,21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42,本日期段的X：1.78 SD：0.23 CV：15.2%,S/co值,质控规则, 2s： 1质控点落在2s之外；, R 4s： 连续2个质控点相差超出4s范围；, 4 1s： 连续4个质控点落在同一侧1s之外；, 7 ： 连续7个质控点落在均值之一侧；, 7 /：连续7个质控点呈连续上升或下降；或周期性波动变化。,室内质控失控报告单,编号：,单位名称： 日期：,试验项目： 方法：,测定仪器： 使用波长：,试剂厂家、批号及失效期：,质控物生产单位： 批号失效期：,失控质控物批号：,当日测试质控次数： 次 ； 当日第 次失控,失控原因：,失控处理及结果：,操作者签名： 质量负责人签名：,5、几点说明,1）开展室内质控的前提条件是什么？,试剂：同一厂家，同一批号；,质控物：同一含量，同一厂家，同一批号,2）质控物更换了批号如何操作？即刻法前3个点是怎样做出来的？,应将“新”批号质控品在“旧”批号质控品使用结束前与“旧”批号质控品一起测定， “新”批号质控品的3个在控测定数据为即刻法前3个质控点，且3个测定点的变异系数必须小于30%，再用这3个点来控制“新”批号质控品所发生的数据。,3）试剂更换了批号如何操作？,将“新”批号试剂测定的质控值标于“旧”批号试剂框架图，看其有无系统误差。如没有，则继续使用原框架；如有，计算“新”批号试剂测定质控值的x与s，再在原框架基础上移动横轴即可。,（四）室内质量控制数据实验室间比对评价,组织者,不同实验室,同一批号,质控物,检测并提交,每月原始,室内质控数据,评价结果相同方法、不同方法,不准确度和不精密度,分析比较,方法：,1、汇总所有数据或单个数据点,剔除显著性离群值。,2、对每一批号质控物、每一项目、使用每一分析方法的所有实验室,计算其平均值、中位数、标准差和变异系数。,3、每月定期评价，对于相同方法组可评价自己方法的不准确度和不,精密度。,比对计划对每一分析项目和每一批号质控物提供下列信息,1、当前月份：均值、标准差（s）和结果个数（N）。,2、计划开始至现在该质控物的累积：均值、s、N。,3、本方法组：方法均值、s（或CV）和所有室个数。,4、每一分析项目所有实验室：所有实验室均值、s（或CV）、实验室,个数。,5、本方法组SDI=(本室均值-本方法组均值)/本方法组s,6、所有实验室SDI=(本室均值-所有实验室均值)/所有实验室s, SDI在2之间是,“,可接受的,”,7、本方法组CVI=本室s /本方法组s =本室CV/本方法组CV,8、所有实验室CVI=本室s /所有实验室s =本室CV/所有实验室CV, CVI 1.5 表示“可接受的”, SDI和CVI是表示方法不准确度和不精密度的指标。, SDI是本室均值与相同方法均值比较其接近程度的指标。,HBV DNA定量PCR室内质控数据实验室间比对的统计量实例,项目,本室,本方法组,所有实验室,对数均值,3.53,3.65,3.72,标准差,0.54,0.64,0.72,变异系数,15.3%,17.5%,19.4%,结果或实验室数,50,45,120,本方法SDI,（3.53-3.65）/0.64= -0.19,接受,所有实验室SDI,（3.53-3.72）/0.72=-0.26,接受,本方法CVI,0.54/0.64= 0.84,接受,所有实验室CVI,0.54/0.72= 0.75,接受,1、与相同方法实验室的比对,作用：评估总的分析过程、评价特定的仪器是否准确,本室的均值与本方法组的均值：显著性地偏离,要检查或校准：,特定的试剂批号、仪器设置或分析过程的其它部分。,HBV DNA定量PCR室内质控数据实验室间比对的统计量实例,项目,本室,本方法组,所有实验室组,对数均值,3.25,5.97,3.25,标准差,0.48,1.31,0.92,变异系数,14.7%,21.9%,28.4%,结果或实验室数,50,45,120,本方法SDI,（3.25-5.97）/1.31= -2.08,不接受,所有实验室SDI,（3.25-3.25）/0.92= 0,接受,本方法CVI,0.48/1.31= 0.37,接受,所有实验室CVI,0.48/0.92= 0.52,接受,2、与所有实验室的比对,上表显示HBV DNA本方法SDI（-2.08） -2.0 实验室间比对报告,的实例。,注意：本室均值与所有室均值一样，但是与本方法组均值比较不,太好，这样，我们需要问两个问题：,1、是否报告了正确的方法；是否处在正确的方法组？,2、本方法组比对数据是否有效？有多少实验室报告？,是否可能由于一个或两个异常结果使得数据发生偏离？,HBV DNA定量PCR室内质控数据实验室间比对的统计量实例,项目,本室,本方法组,所有实验室,对数均值,5.39,5.42,3.21,标准差,0.79,1.18,0.56,变异系数,14.7%,21.9%,17.4%,结果或实验室数,50,45,120,本方法SDI,（5.39-5.42）/1.18=-0.03,接受,所有实验室SDI,（5.39-3.21）/0.56= 3.89,不接受,本方法CVI,0.79/1.18= 0.67,接受,所有实验室CVI,0.79/0.56= 1.41,接受,上表显示：本室相对所有实验室SDI为3.89，高于所有室均值2倍标,准差以上。,本室均值与本方法组均值比较一致，与所有室的均值有差异，偏倚可,能是由于质控样本产生的缘故。,当只与使用特定方法的实验室相比对时，有关质控物的性能会显示很,好的一致。,使用本方法组的结果不同于所有实验室组的均值，是因为质控物的基,质效应或本分析过程固有的特征所引起。,比对评价运行方式(湖北）,开始时间：2013年3月,比对材料：使用统一质控物,专用的CLInet-IQC系统软件（基于web方式室内质控数据实时监,控系统（北京科临易检）,通过互联网交换数据,评价方式：每月一次，一年十二次。,评价项目：乙肝五项、丙肝抗体、艾滋病抗体及梅毒抗体。,参加单位数：142家,三、分析后的质量控制,1、弱阳性质控常见的失控原因,核酸提取中的随机误差：,核酸提取的丢失；,有机溶剂去除不彻底；,标本中扩增抑制物的残留。,仪器的问题：,扩增仪孔间温度的不均一；,孔内温度与所示温度的不一致等。,试剂的问题：,Taq酶和/或反转录酶的失活；,探针的纯度；,标记效率和核酸提取试剂的效率等。,2、阴性质控常见失控原因：,以前扩增产物的“污染”；,核酸提取过程中标本间的交叉“污染”；,试剂的污染。,测定结果的报告,结果报告必须简单清楚。,1、定性测定：报告“阳性”或“阴性”即可；,2、定量测定：则必须报告量的多少。,如结果高于测定方法线性范围上限，则对样本稀释后再测，结果乘上稀释倍数；,如结果低于方法的测定范围下限，则报告小于多少即可，不能报告为“0”或“阴性”。,过去报告拷贝数，现在全部统一为IU/ML。,室间质量评价（EQA）,EQA根据其目的可分为自我教育和执业认可两大类。,1、前者以英国国家室间质量评价计划（ NEQAs）的,EQA为代表；,2、后者则以美国 CAP的能力验证（PT）为范本。,一、EQA的程序设计,1、确定质评方案，定期发放质评样本；,2、报告结果的单位要一致，便于统计；,3、报告要清楚、简洁；,4、在测定EQA样本时，要以与常规样本完全相同的方式测定；,5、对测定方法、试剂及仪器等归纳总结评价；,6、对参评实验室的测定要有评价；,7、EQA报告要迅速及时。,（一）质评样本,1、样本基质与患者标本应尽量一致。,2、样本浓度与临床应用相适应。,3、样本在发放的条件下稳定。,4、不存在不可避免的传染危险性。,室间质评样本的组合设计原则是：,每次质评样本数可为5 8份。,包括1 2份强阳性、1 2份弱阳性、1 2份阴性,及2 3份中等阳性（可为同一样本）样本。,（二）质评样本的靶值,定性测定：,1、明确的阴性或阳性；,2、公认的试剂盒检测确定。,定量测定：,1、以公认的参考方法定值,2、参加质评实验室的修正均值（剔除超出值3s以外的值后计算得到的均值）,3、参考实验室均值2s或3s为准。,（三）对测定技术的评价,按所用的测定方法、仪器和试剂等进行分组；,定性测定：,计算每一种测定方法、仪器和试剂对每一份质评样本的,测定符合情况，以便于相互比较；,定量测定：,计算每一种测定方法、仪器和试剂对每一份质评样本的,测定均值和SD；,二、EQA的局限性,没有同等地对待EQA样本和患者样本；,当使用单一靶值时，难于评价单个实验室和测定方,法；,可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发展；,在不同的EQA程序中，对实验室的评价可能不同。,湖北省临床基因扩增检验能力验证现状,感谢大家的聆听 ！,