双向电泳蛋白样品的制备

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,双向电泳样本制备,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1,一,、蛋白质提取原则：,二、样本裂解方式：,三、2D蛋白裂解液组成及作用：,1：裂解液组成及作用,2：常见裂解液,四、蛋白质提取步骤：,五、蛋白质样本制备实例：,1：动物组织样本制备,2：植物组织样本制备,六、样本制备试剂：,双向电泳样品制备：,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,2,1: 蛋白质制备主要目的：,(1)：细胞，组织的破碎裂解,(2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与,非蛋白质之间的共价与非共价相互作用,2: 蛋白质制备主要遵循的原则：,(1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使,蛋白质以分离的多肽形式存在。,(2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。,(3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。,(4): 去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。,(5): 防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。,(6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。,一,、双向电泳样本制备原则,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,3,破碎的方法,适用材料,原理,渗透裂解,血细胞,组织培养细胞,将细胞悬浮在低渗透液中裂解细胞。,冻融裂解,细菌细胞,组织培养细胞,利用液氮将细胞迅速冻结后再融化。如果需要，可反复进行。,去垢剂裂解,组织培养细胞,去污剂能溶解细胞的细胞膜从而破坏细胞。注：如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可将裂解的样品在含有过量的非离子或兼性去污剂的溶液中稀释或利用沉淀法, 除去SDS。,酶裂解,植物组织,细菌细胞,真菌细胞,在等渗透液溶液中用酶处理细胞。如溶菌酶用于细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞）。,二、双向电泳样本裂解方式温和裂解方式,4,破碎方法,适用材料,原理,超声波法,：,细胞悬浮液,通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。,高压法,：,带细胞壁的微生物,在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细胞,研磨法,：,固体组织,微生物,利用研杵手工将它们破碎,机械匀桨法,：,固体组织,可用手动匀浆器或电动匀浆器能来破碎细胞悬浮液或较柔软的组织。,滚珠粉碎法,：,细胞悬浮液,微生物,旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。,二、双向电泳样本裂解方式剧烈裂解方式,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,5,组成,种类,作用,变性剂,脲、硫脲、两者的混合物,破坏氢键等次级键，使肽链链伸展，暴露疏水中心,去垢剂,非离子去垢剂、两性离子去垢剂、阴离子去垢剂,破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。,还原剂,-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）, TBP,断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的分离,蛋白酶抑制剂,PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂，磷酸酶酶抑制剂,抑制蛋白酶活性,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,6,1、变性剂：,(1) 作用：改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展,开来，充分暴露疏水中心。,(2) 分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特,别是膜蛋白。必须避免将含有尿素的溶液加热到30度以上，,因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的,电荷。,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,7,2、去垢剂：,(1) 作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。,(2) 种类：,a: 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40,b: 两性离子去垢剂：,CHAPS,CHAPSO,SB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中）,ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力）,c: 阴离子去垢剂：SDS（小于0.25%，同时确保其他去垢剂与SDS的比例至少为8：1）,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,8,3、还原剂：,(1) 作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的分离。,(2) 分类: -巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,二硫赤藓糖（DTE）,a: 其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围 以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10100 mmol/L.,b: 采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,9,种类,作用,PMSF,不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶,EDTA，EGTA,可逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂）,多肽蛋白酶抑制剂,逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂）,磷酸酶抑制剂,抑制磷酸酶活性,Benzamidine,抑制丝氨酸蛋白酶。,4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,10,1、 提取前准备：,（1）: 提取总蛋白，亚细胞蛋白；,（2）: 裂解细胞的方式选择；,（3）: 裂解液的选择。,2、 加入裂解液，冰上放置一段时间。,3、 离心去沉淀，收集上清蛋白。,4、 用于二维电泳时，考虑是否有必要除去干扰物质，如核酸，,脂类，盐等,。,三、双向电泳样本制备简要实验步骤,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,11,五、双向电泳样本制备实例动物样本,（1）,将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。,（2）,在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）,粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。,（3）,超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。,（4）,将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。,(5),在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,12,五、双向电泳样本制备实例植物样本,（1）,植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。,（2）,在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。,（3）,加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。,（4）,加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。,（5）,对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。,13,五、双向电泳样本制备实例：,（6）,加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。,(7),在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,14,六、双向电泳样本制备试剂,Alklysis buffer(LB),Reagent,Final concentration,Tris,20mM,Thiourea (FW 76.12),2M,Urea (FW 60.06),7M,CHAPs (FW 64.89),2%(W/V),Phenol extraction buffer,Reagent,Final concentration,Sucrose (FM 342.30）,0.7M,KCl（FM 74.55）,0.1M,EDTA（FM 292.25）,50mM,Tris（FM 121.14）,0.5M,HCl,To pH7.5,醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol,用甲醇配制0.1M的醋酸铵,15,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,THANKS!,16,