血细胞染色

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞化学染色检验,(blood cells chemical staining laboratory),李群,瑞士染色,POX染色,目的要求：,1 了解各类血细胞化学反应的原理。,2 掌握细胞化学染色结果的判断及临床意义,概念,细胞化学染色,是以形态学为基础，结合运用化学反应 的原理对血细胞内各种化学物质、代谢成份（如酶类、酯类、糖类、铁、蛋白质核酸等）作定性、定位、半定量的分析方法。,目的：,辅助判断急性白血病细胞类型 eg：POX 酯酶,辅助血液系统疾的诊断和鉴别诊断 eg：NAP,观察疾病疗效和预后,探讨发病机制,基本操作,固定保持细胞结构及化学成份不变。,1物理法：干燥 火焰,2化学法：甲醛、乙醇、甲醇、丙酮,显示通过化学反应形成稳定的有色沉淀,常有的化学反应：,1偶氮偶联法 酯酶染色,2联苯胺法 POX,3普鲁士兰反应 铁染色,4雪夫反应 PAS,5金属沉淀法 NAP,复染使细胞显示出来，颜色要与有色沉淀,有明显对比度,常用血细胞化学染色,1、过氧化酶染色（POX）,2、非特异性酯酶染色（NAE）,3、糖原染色（PAS）,4、中性粒硷性磷酸酶染色（NAP）,5、铁染色,“,过氧化物酶染色（POX）(peroxidase-stain),POX的性质:,酶类,结合蛋白,POX的存在：,生物体内,线粒体和溶酶体中,中性粒细胞含量,最多.,POX的功能：,破坏氧化过程有剧毒的过氧化物。,原理：,细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生,态氧，后者使试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝（不稳定的中,间产物质位于酶所在位置，于空气中可变为蓝黑色）,H,2,O,2,H,2,O+（O）,无色联苯胺,（O）,（蓝色）联苯胺蓝二苯醌二胺（蓝黑色）,不稳定中间产物 （在空气中）,结果判断,：,阴性：,无颗粒,弱阳性：,细小颗粒，分布稀疏，少,阳性：,颗粒粗，分布密集,强阳性：,颗粒粗大，充满胞质,各类血细胞的染色反应,1 粒系：分化差的原始粒： 阴性,分化好的原始粒中性成熟粒细胞 阳性,嗜酸粒细胞 : 阳性颗粒粗大,嗜碱粒细胞 : 阴性,2 单核细胞系：,原始单阴性,幼单、成熟单弱阳性（大部分）,3 红系、淋巴、巨核细胞、浆细胞、组织细胞 : 阴性,4 组织细胞 : 阴性 吞噬网状细胞有时为阳性,5 遗传性POX缺乏症： 阴性,临床意义,1 鉴别急性白血病（粒、淋、单）,2 区别小原粒与原始淋,3 急性早幼粒白血病与急性单核细胞白血病,4 急单与组白及恶组病的鉴别,成熟中性粒细胞POX活性变化,：再障、感染（化脓性细菌性感染）、急淋、慢淋,：急粒、慢粒、急单、MDS、放射病、退化的中性粒,瑞士染色,POX染色,注意事项,过氧化氢要保证质量，乙液要新鲜配制，浓度一定要控制，否则 反而抑制酶（0.05mol/L）,在甲液上加乙液后要马上混匀，否则染色情况不一致,加过氧化氢低倍镜下出现阳性颗粒，马上就冲，否则弱阳性不好看。,苏丹黑B染色(sudan black B stain),苏丹黑B（SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解细胞,内含酯结构，使酯类物质显示出来。,SBB与POX比较：,POX特异性高，临床首选,SBB敏感性高,酯酶染色法,(esterase-stain),酯酶性质：,水解酶,酯酶存在：,人和啮齿类动物血细胞内含有多种酯,酶及同工酶,分类：,特异性酯酶染色：,氯乙酸AS-D萘酚酯酶（AS-D NCE）,非异性酯酶染色：,1 中性：,-醋酸萘酚酯酶（-NAE）（敏感性高）,醋酸AS-D萘酚酶（AS-D）,2 酸性：酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）,鉴定T、B淋 巴细 胞,3 碱性：-丁酸萘酚酯酶染色（-NBE）：（特异性高） - 单核-巨噬细胞的标志酶,中性非特异性酯酶染色,（-NAE）,（-醋酸萘酚酯酶）,（-）原理：,酯酶,（-NAE）,在PH中性条件下,将基质液中-醋酸萘酚水解产生-萘酚，-萘酚与重氮盐（坚牢兰）偶联，生成不溶的有色沉淀（灰黑色）,定位在酶所在的部位.,加氟化钠抑制试验抑制、不被抑制,-NAE存在于单核细胞 粒细胞及淋巴细胞中,故为中性非特异性酯酶染色,;,单核细胞 的阳性可被氟化钠抑制故做-NAC染色时,同时做氟化钠抑制试验,结果：,阳性：胞浆内有灰黑色或棕黑色弥漫性颗粒状沉淀,阴性：无色,正常血细胞,-NAE,染色反应,1 单核系：分化差的原单（-）,分化好的原单（+） +NaF 抑制,幼稚单成熟单（+） +NaF 抑制,2 粒系：各期粒细胞（-）少数（） +NaF 不被抑制,3 淋巴系：各期淋巴（-）少数（） +NaF 不被抑制,4 红系：各期幼红细胞（-）少数（） +NaF不被抑制,5 其他：巨核细胞、血小板（+） +NaF 不被抑制,-NAE -NAE+ +NaF 抑制,临床意义：,辅助鉴别急性白血病,急单 急粒 急性早幼粒 急淋 红白或红血病,+ （-）或（） + （-）或（） +（幼红细胞）,+NaF 抑制 不抑制 不被抑制 不被抑制 不被抑制,特异性酯酶染色（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色）(naphthol AS-D chloroacetate esterase),特异性酯酶染色,（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,）,特点：特异性高，只出现在粒细胞中（以称粒细胞酯酶）,原理：,血细胞内AS-D萘酚酯酶水解基质液中氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液重氮盐（坚牢兰）偶联，生成不溶的有色沉淀（灰黑色）,定位在酶所在的部位.,意义：辅助鉴别急性白血病类型,正常血细胞染色反应：,1粒系：分化差原始粒（-） 分化好原始粒（+）,早幼成熟中性粒（+）（早幼、中幼阳性最强）,嗜酸、嗜碱（-）或（）,2 单核（-） 个别（）,3 肥大细胞：（+）,4 自然杀伤细胞（NK） 阳性率约50%,5 其他细胞：淋巴、浆细胞、巨核细胞、幼红细胞、血小板（-）,意义：辅助鉴别急性白血病类型,1.急粒（+） M3 强（+） 急单（-） M7（-）,2.急粒-单白血病 原.早幼粒（+） 原.幼单（-）,3.急淋（-） NK白血病50%（+）,糖原,（PAS）,染色,(periodic acid-Schiff reaction),糖原染色原理：,糖原染色又称为过碘酸-雪夫染色,过碘酸是氧化剂，能氧化多糖物质（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖脂等）中的乙二醇基-（HOH-CHOH），形成醛基-CHO-CHO，醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的亚硫酸品红（失去亚硫酸重新排列，恢复品红的对醌结构）变成紫红色物质，定位于多糖类的细胞内。,PAS染色形态状描述：,颗粒状，小块状（包涵体状），弥漫均匀红色。,PAS阳性程度判断：,阴性： 无颗粒,弱阳性：细颗粒,阳性： 粗颗粒,强阳性：大、小块状,正常血细胞PAS染色反应,正常血细胞PAS染色反应,粒系：分化差的原始粒（-）,分化好的原始粒中性分叶核 + 逐渐增强,嗜酸：颗粒不着色，颗粒间呈红色,嗜碱：颗粒（+）颗粒间不着色,红系：（-）,单核细胞系统：,分化差的原单（-）,分化好的原单成熟单：细胞颗粒（+）弥散分布,（边缘可见粗大颗粒）,淋巴细胞系统：大多数（-）20%（+） （粗颗粒及块状）,巨核细胞系统：（+） 血小板（+）,其他： 浆细胞（-）或细颗粒（+）,巨噬细胞：细颗粒（+）,临床意义：,1 红血病、红白血病、MDS（+）（块状或均匀红色）,2 辅助鉴别白血病,急淋 急粒 急单,（+） （+）或（） （+）,粗颗粒或块状 均匀淡红色或细颗粒状 细颗粒弥散分布,巨核细胞白血病（M7） 嗜碱性粒细胞白血病 慢淋,（+） （+） （+）,粗颗粒或小珠、块状,3 其他：,戈谢(Guqcher) 尼曼-匹克(Nieman-Pick),强 （+）,弱（+）或（-）,Reed-sternberg 腺癌 组织嗜碱细胞,（-）或（） （+） （+）,尼曼-匹克(Nieman-Pick ),瑞士染色 PAS染色,碱性磷酸酶（NAP）染色,(neutrophilic alkaline phosphatase-stain),存在: 成熟中性粒细胞内,主要见于分叶核及杆状核.,根据其酶染色强弱而来协助诊断及鉴别于其它疾病。,NAP染色方法,Comori 钙-钴法：,Kaplow 偶氮偶联法 试剂盒,Kaplow 偶氮偶联法原理：,成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH 9.49.6碱性环境中，水解基质液-磷酸萘酚钠底物，释放出-萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性灰黑色沉淀，定位在胞质酶活性所在之处。,NAP正常值：,阳性率：10%40% 积分：4080分,（各单位应建立本实验参考值）,碱性磷酸酶（NAP）染色,钙-钴法原理,中性粒细胞中有碱性磷酸酶存在时，可分解-甘油磷酸钠，为磷酸钠和甘油。磷酸钠再与硝酸钙、硝酸钴、硫化铵起一系列的化学反应，最后生成黑色的硫化钴，沉淀于细胞浆中，用来测定中性粒细胞中NAP,活性,结果：,1 阳性反应：胞浆中出现灰色或棕黑色沉淀。,2 阳性反应分级标准。,（）无色,（+） 胞浆浅灰色，均匀无颗粒或仅少部分胞浆有灰黑色沉 淀,（+） 胞浆灰黑色或出现稍致密棕黑色片状沉淀,（+）胞浆充满棕黑色片状沉淀，但分布均匀，密度较低，较,密，团块较少,（+）全部胞浆深黑色，并充满致密团块沉淀，甚致黑色沉淀可,遮盖胞核,NAP阳性强度判断,积分法,观察100个成熟中性粒细胞（分叶、杆状），按其反应强度求其百分率，各级百分率与其级数乘积的总和即为积分。,eg：“0” 10%,“+”20%,“+”40%,“+”20%,“+”10%,阳性率=20+40+20+10=90%,积分=（120）+（240）+（320）+（41 ） =200,正常值,NAP阳性率：1030% 积分：50,成熟中性粒细胞（分叶、杆状),呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性,临床意义：,NAP生理变化,1 年龄“新生儿 儿童成人老人 (活性),2 应急：紧张、恐惧、激烈运动：,3 月经：经前： 经后： 经 后期恢复,4 妊娠：23月：（轻度） 分娩：高峰 产后：正常,NAP病理变化,1 NAP,积分,：,细菌感染、AA、某些骨髓增殖性疾,病，如慢中粒白血病、骨纤、真红、原,发性血小板增多症、慢粒（加速期、急,变期）、急淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转,移癌、肾上腺糖皮质激素及雄性激素治,疗后,NAP积分：,慢粒（慢性期）、急,粒,、,MDS、恶组、PNH、,ITP、 传单、粒缺、病毒感染,NAP疾病鉴别, ,PNH AA,病毒感染 细菌感染,慢粒 类白反应,慢粒 慢中粒,恶组 淋巴瘤,恶组 反应性组织细胞增多症,急粒 急淋,继发性红细胞增多（无变化） 真红,继发性血小板增多症（无变化） 原发性血小板增多症,重点、难点：,基质液的配制、结果判定、临床意义。,注意事项：,1 基质液要新鲜配制,2 基质液PH一般为9.49.6 PH9 酶活性下降，,PH10 细胞易破碎。,3 涂片应新鲜，一周内固定，染色。,4 每次染色要有阳性对照。,酸性磷酸酶ACP,(acid phosphatase ACP),和抗酒石酸酸性磷酸酶染色,(tartyate-resistant phosphatase TRAP),酸性磷酸酶ACP与细胞的许多生理功能和病理变化有关，血细胞的ACP有7种同工酶（ACP0、1、2、3、3b、4、5），某些血液病与ACP同工酶出现有关。ACP0存在于Gaucher细胞.单核细胞和巨噬细胞； ACP3存在于淋巴细胞； ACP 3b存在于各型AL的原始细胞；ACP 5存在毛细胞。ACP1、2、4存在于中性粒细胞,ACP染色方法：硫化铅法,偶氮偶联法,硫化铅法原理：,血细胞内ACP酸性条件下（PH5.0），可分解-甘油磷酸钠，产生磷酸根。磷酸根再与硝酸铅作用生成磷酸铅、沉淀于细胞浆中磷酸铅与硫化铵反应，最后生成黑色的硫化铅沉淀。,抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）,抗酒石酸酸性磷酸酶染色，用相同方法制备两份基质液，一份加L-酒石酸，一份不加L-酒石酸，取两张同标本涂片，分别用两种不同基质液做ACP染色。如果血细胞内ACP耐酒石酸，两张均阳性，如不耐酒石酸，则不加酒石酸者阳性，加酒石酸者阴性。,铁染色 (ferric-stain),正常骨髓中有一定量的铁，以铁蛋白和含铁血黄素形式储存，用以合成血红蛋白，这种储存的铁称细胞外铁。幼红细胞内含有铁颗粒（铁蛋白）存在于胞质中，这类红细胞称铁粒幼红细胞。,铁染色的目的是,了解体内铁的贮存及利用情况。,铁染色化学反应原理,骨髓粒中的含铁血黄素（细胞外铁）和幼红细胞中的铁粒（细胞内铁）其中三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后，而游离，与酸性低铁氰化钾起反应，形成普鲁士兰色的亚铁氰化铁.根据反应的强弱，了解骨髓中铁的含量。,结果：,1 细胞外铁检查：,将铁染色的骨髓片先用低倍镜观察，再用油镜检查片中未尽展开的骨髓碎粒，铁颗粒呈浅蓝色、深兰色，共分五等。,（-） 无铁颗粒可见。,“+” 有少数铁颗粒或仅偶见少数铁小珠。,“+” 有较多的铁颗粒和小珠。,“+” 有很多铁颗粒小珠和少数小块。,“+” 有极多铁颗粒小珠，并有很多小块。,正常值： 2/3的人为“+” 1/3的人为“+”,细胞外铁,+,+,+,+,2 细胞内铁检查：,幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁颗粒呈兰绿色。,计数100个幼红细胞，并记录含铁颗粒的阳性和阴性比例，算出百分率，并根据细胞内铁颗粒的数目、大小，染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型。,I型：含铁12粒,II型：35粒,III型：69粒,III型：含10粒以上铁颗粒,正常值：,细胞内铁：19%44% 以I型为主 少数为II型,（无环形铁及铁粒红细胞）,环形铁粒幼红细胞的标准：,粒幼红细胞含有粗大深染的铁颗粒含10粒以上，其中2/3以上的铁粒绕核形成完全或不完全性环形（围核1/2以上的区域有铁粒环绕）,铁粒幼红细胞,:幼红细胞内出现铁颗粒,铁粒红细胞,: 成熟红细胞内出现铁颗粒,环形铁粒幼红细胞,: 幼红细胞内出现环形铁,铁染色临床意义：,1 诊断缺铁性贫血，指导铁剂治疗。,2 诊断铁粒幼细胞性贫血,3 MDS-RAS 环形铁15%,4 非缺铁性贫血,内外铁正常或：溶贫、巨幼贫、AA、多次输血,后，白血病,外铁 内铁：感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、,血色病,重点、难点,结果和临床意义,注意事项：,1 玻片要干净，去铁处理。,2 酸性亚铁氰化钾要新鲜配制，要澄清，浑浊要用亚铁氰化钾液滴致清亮。,3 选用有骨髓小粒的片子染色。,总结,-NAE -NAE+ +NaF 抑制,NAP阳性强度判断,四种常见类型白血病细胞化学染色结果,早幼粒白血病 急粒 急单 急淋,POX 强 + +或（-） （-）或（） （-）,PAS 强 + +（均匀红色） +（细胞颗粒） +（粗颗粒）,-,NAE 强 + （-）或（） （-）或强阳性 （-）或阳性+NaF 不抑制 不抑制 抑制 不抑制,病案分析,POX染色,PAS染色,NAP,NAP,End,