脂肪酶的分离纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,脂肪酶的分离纯化,姓名：曹净净,学号：111411201,1,脂肪酶应用,生物柴油,纺织工业,医药,洗涤剂,工业,食品工业,2,脂肪酶结构,脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸,其氨基酸组成数目从 2 70 6 41 不等, 其分 子量 为29 000 100 000。,3,绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等),一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。,脂肪酶结构,残基 261 和 257 的羰基氧原子为Ca,2+,配基;顶端的,螺旋( 浅色的) 表示“盖子”状结构。当脂肪酶与界面相接触时,此盖打开,通过亲电子域的创造导致脂肪酶的构象改变,此亲电子域在丝氨酸残基周围,由疏水残基的暴露和亲水残基的包埋来完成。这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性 中间体的稳定。,4,“盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域，引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活,5,脂肪酶来源,脂肪酶的来源,植物：油料作物的种子,动物：高等动物的胰脏和脂肪组织,微生物：细菌、酵母菌和霉菌,6,脂肪酶的提取,提取法：从动植物器官或组织中提取,化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学方法合成,发酵法 ：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而获得人们所需的酶-假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉,7,影响因子:,生产培养基中存在单糖，双糖或甘油时 ,脂肪酶的形成常受阻遏脂肪酶的大量生产是在葡萄糖在培养基中消耗完及生长停止时。,温度：,脂肪酶的最适作用温度在3060之间， 在较高和较低温度下酶仍具有较高活性。,PH:,大多数细菌脂肪酶最适pH在中性或碱性范围内，pH稳定范围一般在 pH4.011.0 之间。真菌脂肪酶pH稳定范围也较宽，通常在 pH4.010.0 之间。,（氮源）大豆粉 2 (NH,4,),2,SO,4,0.1 ,（碳源）玉米浆 5 K,2,HPO,4,5.5 ,聚乙二醇壬基笨 醚 0.6 ,脂肪酶影响因素,8,微生物脂肪酶的发酵过程,无菌空气,9,脂肪酶的下游分离提取工艺,发酵液,预处理,过滤,菌体,洗液（含酶稀溶液,）,过滤,水洗,（破碎）,滤液+,超滤,浓缩液,粘结剂,辅料,制粒机造粒,涂膜,筛分,成品颗粒酶,无菌过滤,硫铵,固体酶,硫铵回收,10,微生物脂肪酶的下游分离提取工艺,发酵液,丙酮,转鼓过滤器,50%硫酸铵盐化,上层丙酮,下层脂肪酶+丙酮,脱水,丙酮,脂肪酶,废丙酮精馏,脱水,干燥,脂肪酶粉末,11,分析纯：2000-3000元/1kg,衣物除污脂肪酶：150/1kg,食用级脂肪酶：150-500/1kg,纯化次数越多，纯化倍数和比活也越高,但得率却随之下降。 由于经过的层析柱较多, 成本也较高, 因此我们纯化微生物脂肪酶所面临的问题就是不仅要提高纯化倍数和比酶活,还要降低成本。,展望,12,谢谢！,13,