二硝基水杨酸定糖法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,二硝基水杨酸定糖法,实验目的,掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法,学习分光光度法测定的原理和方法,实验原理,还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由,醛基,或,酮基,的糖类，,单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖,。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,还原糖在,碱性条件下,加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为,棕红色,的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成,正比关系,，利用分光光度计，在,520,nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。,实验试剂与器材,1、实验材料：面粉。,2、实验试剂,（1）、1mg/mL葡萄糖标准液,准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。,（2）、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂,将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。,（3）、碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。,（4）、酚酞指示剂：称取酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。,（5）、6M HCl和6M NaOH各100mL。,（二）、实验器材,（1）具塞玻璃刻度试管：20mL11,（2）大离心管：50mL2,（3）烧杯：100mL1,（4）三角瓶：100mL1,（5）容量瓶：100mL3,（6）刻度吸管：1mL1；2mL2；10mL1,（7）恒温水浴锅,（8）沸水浴,（9）离心机,（11）,分光光度计,分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合比色原理Lambert-Beers law:,数学表达式: A=lg(1/T)=KCL A为吸光度 T为透射率,是投射光强度比上入射光强度 C为吸光物质的浓度 L为吸收层厚度 K为吸收系数 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.,仪器操作键介绍,“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式,“100%T/0ABS”键：用于自动调整透射比)或0ABS(零吸光度),“0%T”键：用于自动调整零透射比,“波长设置”旋钮：用于设置分析波长,样品测试操作, 打开电源开关，使仪器预热20分钟, 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上, 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路, 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零, 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比, 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A), 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中, 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖, 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A, 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数,实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。,使用注意:,每次测量前检查,检查波长是否所需值,;,比色皿应拿磨砂面,不可用手接触透光面,;,比色皿在盛装样品前,应用所盛样品冲洗两次,装样量为比色皿的,2/3,容积,;,向比色皿加样时,若样品流到比色皿外壁时,应用滤纸点干,切忌用滤纸擦拭,以免比色皿出现划痕,;,测量结束后应用蒸馏水清洗比色皿,清洗干净后放起,.,操作方法,1、葡萄糖标准曲线的测定,取6支20mL具塞刻度试管编号，按表1所示分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。,将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长520nm，用0号管调零点，测出15号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。,2、样品中还原糖和总糖的测定,（1）、还原糖的提取,准确称取食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml,。,（2）、总糖的水解和提取,准确称取食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。,（3）、显色和比色,取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。,结果与计算,计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。,思考题,1、3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?,2、如何正确绘制和使用标准曲线?,谢谢！,