HPLC和CE衍生试剂

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂,为什么衍生,衍生方式,衍生试剂的构成与要求,衍生试剂 种类及应用,1,液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂,2,为什么衍生,检测方法与检测信号,化学衍生主要是用于改善检测灵敏度,不好线性检测或较窄线性范围检测和高检出限的分析物，通过衍生得到改善,不能与其它基体物质分辨的分析物，通过衍生可以扩大差别,荧光生成（fluorogenic）试剂和荧光标记（fluorescent label）试剂.,3,衍生反应方式,柱前衍生（pre-column derivatizations）,柱后衍生（post- column derivatizations),柱中衍生 （on column derivatizations),离线（off line)柱前衍生,在线（on line)柱前衍生，,离线（off line)柱后衍生,在线柱后衍生,4,柱前衍生,自由性大,衍生与柱分离的流动相无关,提高检测灵敏度,改善分离方法选择性和色谱分辨率,易于优化反应条件 衍生物稳定 产率高 副反应产物少,选择易与色谱流动相混合的溶剂作为衍生溶剂,5,在线柱后衍生,柱后反应器,衍生反应不强调生成单一的稳定的衍生产物,过量的衍生试剂干扰检测,要求快速并允许现时检测,加泵供给衍生试剂,反应溶剂必须与分离用的流动相易混溶,衍生试剂与柱淋洗液有效混合,6,柱中衍生,这一衍生方法基本是把衍生试剂溶入流动相，注射样品后，在柱上分析物与流动相中的衍生试剂反应,方法适于不太稳定的衍生物，反应要快,所需衍生试剂量较大，昂贵的衍生试剂不应采用此法.,7,衍生试剂的构成与要求,衍生试剂必须含有可检测的基团，即显色团（chromophore）、荧光团（fluorophore）和电基团（electrophore）,含有反应基团如FITC,8,9,衍生试剂稳定 要纯，不含杂质，,形成一种衍生物，尽可能没有副产物形成,尽可能高衍生物产率；,需衍生试剂尽少，避免试剂峰的干扰.,对于柱后衍生试剂，同样须具有的共同条件外，应：（1）试剂与被分析物反应迅速；（2）衍生试剂转化率高，过量少，以免干扰衍生物的检测.,10,进展文献,邓樱花，王红，张华山，高效液相色谱和毛细管电泳分离荧光检测小分子氨基生物物质的进展 ，分析科学学报，2010，26（1）：103,11,衍生试剂 种类与应用,胺的衍生试剂,巯基的衍生试剂,羟基的衍生试剂,羰基化合物的衍生试剂,羧酸的衍生试剂,分离对映体的手性衍生试剂,12,被衍生的氨基化合物,氨基酸,神经递质氨基酸,谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、-丙氨酸(-Ala)、牛磺酸(Tau)等,神经递质,多巴胺、肾上腺素、去甲基肾上腺素,小肽和肽段,二甘肽，三甘肽，谷胱甘肽，脑啡肽等,磷酸化氨基酸,磷酸化丝氨酸(P-Ser)、磷酸化苏氨酸(P-Thr)和磷酸化酪氨酸,脂肪胺,生物胺,腐胺、尸胺、精胺、亚精胺,蛋白质,13,14,胺的衍生试剂,芳香邻二醛类,异硫氰酸酯类,酰氯类,羰酰氯类,磺酰氯,活性卤类,N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类,其它,15,芳香邻二醛类,OPA、2，3-萘二醛（NDA）、3-（2-呋喃甲酰基）-喹啉-2-羰醛（FQCA）、3-（4-羧基苯甲酰基）-喹啉-2-羰醛（CBQCA）,.,16,17,18,Fig.1-2.,Typical electropherogram of a 500 nL aliquot of derivatized microdialysate from the rat striatum. The separation buffer was 75 mM borate buffer (pH 9.2) containing 70 mM SDS and 10 mM HP-,-CD. IS was cysteic acid.,He-Cd,激光器,Electrophoresis,2003, 24,31873196,2, 3-萘二醛(NDA)衍生CE-LIF分离检测活体中的,GABA、Glu、L-,Asp,检测限: 0.6-3 nM,19,.异硫氰酸酯类,苯异硫氰酸酯（PITC）,PITC PTC-氨基酸 PTH氨基酸,20,Edman试剂,紫外检测 254nm,衍生物稳定，分析时间也较短,副产物、溶剂等多种干扰因素可通过高效蒸发除去,较烦琐,30min内分离20余种氨基酸,21,22,4-N，N-对二甲胺基偶氮苯-4-异硫氰酸酯（DABITC ）,4-（5，6-二甲氧基苯并噻唑）苯异硫氰酸酯,荧光素异硫氰酸酯（FITC）,23,J. Chromatogr. B, 2001, 758, 277-282,Fig. 1-1. Electropherogram of standard amino acids (each amino acids concentration: 2.510,-8,M). (1)Arg, (2) Lys, (3) Gln (4) GABA, (5)Ala, (6) Gly, (7) Glu, (8) Asp,(a) FITC, (b) decomposition products of FITC.,下丘脑的神经递质氨基酸在运动中枢神经中起着重要作用,荧光素异硫氰酸酯(FITC)衍生CE-LIF分离测定大鼠下丘脑中的八种氨基酸,衍生条件：pH 10 硼砂缓冲溶液, 室温, 避光17 h,24,Fig. 1-3. Typical chromatogram of SIFA derivatives with amines.Mobile phase: methanolwater (46/54, v/v) solution containing10 mmol/L pH 5.40 citric acidNa2HPO4 buffer; amine concentration: 0.1 mmol/L; fluorescence detection wavelengths: ex,/,em = 488,/,516 nm. (1) Methylamine (2) ethylamine (3) ethylene diamine (4) FOAA (hydrolyzed product of SIFA) (5) isopropylamine (6) isobutylamine (7),n,-butylamine (8)1,4-butylene diamine (9) 1,5-amylene diamine. Reprinted from ref.197 ,25,酰氯类,磺酰氯类（-SO,2,Cl）,和羰酰氯（-COCl）,26,丹磺酰氯 DNS-Cl,.,5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，熔点69-71,o,C,激发波长350nm，发射波长530nm.,衍生反应所30min到2h 非水溶液衍生时间较短,衍生物产率受介质pH值和水的含量,影响,稳定12-24h，对紫外光比较敏感，衍生反应须避光进行，衍生物要避光存放.,测定了22种氨基酸并用于人体血浆样品，检测限1.0pmol 紫外检测，灵敏度低，检出限仅50-100pmol.,27,ODS柱（1254.6mm，3m）；流动相：A，3%四氢呋喃的15mmol/L磷酸钠缓冲,溶液（pH6.3）；B，60%乙晴的15mmol/L磷酸钠缓冲溶液（pH6.3）；梯度淋洗；,柱温，25,o,C，荧光检测，ex330nm，em550nm,28,其它磺酰氯衍生试剂,p-4，4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）,5，5-二丁氨基-1-萘磺酰氯（BNS-Cl）,N-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酰氯,4-萘-1-偶氮-（4-二甲氨基苯）磺酰氯,香豆素-6-磺酰氯（C-6-SO,2,Cl）,29,羰酰氯,9-芴甲基氯甲酸酯，9-芴甲氧基羰酰氯（FMOC-Cl）,ex265nm，em310nm,在室温和碱性条件下，衍生反应30s完成.衍生产物很稳定,二元梯度淋洗，23min分离了22种生理氨基酸 检出限1.0pmol,测定地下水中的二甲基胺,64,和法国红酒中组胺、精胺等生物胺,FMOC-Cl的水解产物有相似的荧光强度，上柱分离前须除去，戊烷萃取,30,SuperspherCH-8（1254.0mm）；流动相：A，20%乙晴的50mmol/L乙酸钠缓冲,溶液（pH4.2）；B，70%乙晴的50mmol/L乙酸钠缓冲溶液（pH4.2）；梯度淋洗；,柱温，35,o,C，荧光检测，ex265nm，em310nm,31,Fig.1-1Comparison of separation of 5 FMOC-Cl derivatized neurotransmitter amino acids in N-MEKC and RM-MEKC with reversed migration elution order. Sample: a neurotransmitter amino acid standard. Separation conditions, background electrolyte, 60 mmol/L,boric acid-NaOH (pH 8.60), 40 mmol/L,SDS; capillary 55 cm (47 cm to detector window)350 mm I.D., (a) uncoated capillary,125 kV, 24 mA; (b) coated capillary, 225 kV, 24 mA. Sample concentration, 200 mmol/L; injection; 50 mbar, 10 s. Reprinted from ref. 107,.,32,3，4-二氢-6，7-二甲氧基4-甲基-3-喹恶啉-2-羰酰氯（DMMQC-Cl）,6-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯 （MSQC-Cl）,33,活性卤类,可与一、二级胺反应,34,35,NBD-Cl作为荧光生成试剂用于衍生脂肪胺及氨基酸在弱碱性溶液中进行,NBD-Cl是一个选择性相当好的衍生试剂，虽然它也与醇（-OH）、硫酚（-SH）和苯胺反应 衍生物的荧光强度比脂肪胺低很多,衍生物显示出激发波长最大在480nm，适合Ar离子激发波长,36,NBD-F与氨基乙酸的反应速度比NBD-Cl快500倍在pH8.0、60,o,C及避光 5min内就与氨基酸完成反应. 手性柱上氨基酸对映体的分离.,NBD-Cl与二级氨基酸反应的活性更好. NBD-胺结合物在水中的荧光量子产率很低，小于0.01；而在甲醇溶液中大大增加.,DBD-F在pH8.0和50,o,C，反应2h，DBD-F与氨基化合物同样生成衍生物，用于反相色谱分离氨基酸和脂肪胺类，激发波长466-469nm，检测发射波长594-600nm，检出限亚pmol级,ABD-F的胺衍生物的激发和发射波长紫移，分别为450nm和590nm；荧光强度低2.5倍.,37,2，4-二硝基氟苯是在紫外光区有吸收峰的含活性卤原子的HPLC分离氨基酸的柱前衍生试剂,400nm,在温和条件（pH8-9，室温）与一、二级氨基酸均能反应，衍生物稳定,紫外检测，灵敏度较低，多应用于测定蛋白质的N-末端氨基酸残基,38,N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类,氨基甲酸酯类（AQC）和羧酸酯（SIIA）,39,荧光素-O-乙酸酯（FL-O-Ac-SE ),9-氰基-N，N，N，-三乙基-N-（5-琥珀酰亚胺氧羰基戊基）焦宁氯化物（Pyronin SE）近红外的活性酯荧光衍生试剂，,em,=695nm，衍生氨基酸，CE分离，激光诱导荧光检测限达0.8-4.5amol,40,琥珀酰亚胺-4，4二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸酯（BODIPY-C,3,-SE）,琥珀酰亚胺-9-芴甲氧基甲酸酯（FMOC-SE）,41,42,Fig. 1-3. Electropherograms obtained for separations of five DTAF labeling phosphoamino and amino acids in pH 9.3 borate buffer10mM Brij35. Separation voltage: 25 KV; injection: 50 mbar for 3 s; analyate concentrations: 1,M; peaks: (1) Glu, (2) Asp, (3) P-Tyr, (4) P-Thr, (5) P-Ser.,5-(4,6-二氯-,s,-三嗪-2-氨基)荧光素(DTAF),标记,CE-LIF,检测磷酸化氨基酸,J. Chromatogr. A, 2004, 1049, 237242,线性范围: 0.01-1,M,检测限: 0.5-2 nM,43,图1-4是固定FITC-BSA和BSA抗体的浓度，加入不同量的BSA的示意图。随着BSA浓度不断的增加，游离的FITC-BSA峰不断升高，而FITC标记的抗原抗体复合物的峰不断降低，甚至消失,Fig.1-4 Comparison of electropherograms of competitive CEIA due to adsorption of the analyte to the capillary wall with whole anti-BSA. The reaction mixtures contained FITC-BSA(300 nmol/L), anti-BSA (333 nmol/L) and BSA solution in different concentrations. Buffer, 200 mmol/L,borate, pH 8.5. Applied voltage, 25 kV; 3 s injection; LIF detection. Reprinted from 252,.,44,茚三酮,茚三酮 水合茚三酮 蓝紫色化合物,最大吸收峰570nm.,45,荧光胺，又叫荧胺，它本身没有荧光，它可与一、二级胺反应，,ex,=400nm，,em,=485nm,在室温，pH.9.0，荧光胺与胺衍生反应1s中即可完成，过量试剂几秒内就水解为无荧光的产物,无荧光的二级胺衍生物可在一定条件下再与一级胺反应，同样能形成一个绿-蓝色荧光的产物,46,47,温和条件及六铁氰化钾的存在下，pH6.5-6.8，37-50,o,C二芳基乙二胺类与邻苯二酚胺反应生成荧光产物,荧光团,（结构未知）,48,9，10-菲醌 胍 荧光产物,49,用于肽及蛋白质的序列分析,测定多肽链顺序时，需先将蛋白质裂解成一系列短肽,分别测出它们的顺序，然后再找出它们的结合点，将肽链的氨基酸排序,选择肽链裂解切入点非常重要,多短肽的分离纯化也非常重要,酶解法和化学裂解法,50,测定N-末端的试剂,苯异硫氰酸酯（PITC）,2，4-二硝基氟苯（DNFB）,丹磺酰氯（DNS）,4-N，N-二甲胺基偶氮苯-4-异硫氰酸酯（DABITC）,苯异硫氰酸酯（PITC）化学降解法测定蛋白质顺序 分三步进行降解反应,51,第一步 偶联反应（T代表肽）,52,第二步 裂解反应,ATZ（噻唑啉酮苯胺）,少一个残基的肽,53,第三步 转化反应,PTH（苯乙内酰硫脲）-氨基酸,54,由上述三步便知，-氨基与PITC反应并断裂去以后，紧挨着的下一个残基（第二个）便成为-氨基，接着又与PITC反应并裂解掉这个残基，如此循环降解，就可测序，非常方便,这是Edman试剂的的最大特点，测序仪就是根据这一原理设计而成的.,55,笔答问题,为什么HPLC和CE中要进行衍生？有哪几种衍生方式？原因何在？,56,