AFLP分子标记及其应用

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,AFLP,分子标记及其应用,班级：生技,09-2,姓名：曾和平,学号：,20090276,AFLP,基本原理,AFLP,特点,AFLP,实际应用,内容简介,先利用,两种,限制性内切酶水解基因组,DNA,产生不同大小的,DNA,片段，再使用双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板,DNA,，然后以人工接头的互补链为引物进行,预扩增,，最后在接头互补链的基础上添加,13,个选择性核苷酸作引物对模板,DNA,基因再进行,选择性扩增,，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的,DNA,扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。,AFLP,基本原理,EcoR I,Mse I,（限制性内切酶）,EcoR I,接头,Mse I,接头,EcoR I,引物,+A,Mse I,引物,+C,（预扩增）,EcoR I,引物,+AAC,Mse I,引物,+CAA,（选择扩增）,（连接）,（电泳检测）,4,种分子标记比较,（,3,）可靠性,好,，重复 性,高。,（,1,）,DNA,需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的,AFLP,标记。,（,2,）多态性高。,AFLP,分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条,带，,具有较强的多态分辨能力。,（,4,）对,DNA,模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。,AFLP,结合了,RFLP,和,RAPD,两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。,AFLP,特,点,构建遗传图谱,分析遗传多样性,基因定位,分子标记辅助育种,AFLP,的实际应用,12,个地方鸡种遗传多态性的,AFLP,指纹分析,实验背景,本研究利用,AFLP,方法检测各个鸡种的,DNA,的多态性，构建,12,个地方鸡种的,DNA,指 纹图谱，分析这些地方鸡种相互之间的亲缘关系，为鸡种的鉴定、资源的合理保护和开发利用提供基本资料。,实验材料,血样来自国家家禽品种资源基因库和其它保种区或保种场保存的地方鸡种，共计,12,个品种。每个鸡种取,60,个血液样本，血样采用,70%,的酒精固定、保存。,流程,基因组,DNA,提取,基因组,DNA,的双酶切与接头连接,AFLP,扩增反应,凝胶电泳,数据处理,2. AFLP,分析,基因组,DNA,提取,将每个鸡种所有个体的基因组,DNA,等量混合，构建各个鸡种的池,DNA,。,用,TE,缓冲液将各池,DNA,稀释至终浓度,50 ng/,L,便于,AFLP,分析。,基因组,DNA,的双酶切与接头连接,每个取,4,L,基因组,DNA,，用,Pst,和,Mse,进行双酶切，酶切片段与,Pst,和,Mse,接头连接。,AFLP,扩增反应,预扩增：采用不含选择性碱基,(+0),的预扩增引物，每个样品反应总体积为,25,L,，包括模板,DNA (,酶切连接产物,1,：,10,稀释,)2,L,，,Pre-ampmix 1,L dNTPs1,L,、,10PCR buffer 2.5,L,、,DNA,聚合酶,0.5,L,、,ddH2O 18,L ,反应条件为,94,30 s,，,56 30 s,，,72 80 s, 30,个循环。,72,延伸,5 min,。,选择性扩增：预扩增产物,1 20,稀释后，用于选择性扩增。选择性扩增引物,5,和,3,端各带有,3,个选择性碱基，选取,6,种引物组合进行选择性扩增。,选择性扩增采用,梯度,PCR,方法,反应条件为：第一循环扩增参数,94,30 s,，,65,30 s,，,72,80 s,以后每个循环温度递减,0.7,，扩增,12,个循环，经,13,个循环后退火温度降到,55,，再进行,23,个循环的扩增。,凝胶电泳,荧光标记的,PCR,扩增产物用,4%,琼脂糖凝胶电泳检测，再向,2,L,的扩增产物中加,2,L,上样缓冲液,(10%,蓝色葡聚糖,),，同时加,1,L GENEMARK500,荧光,DNA,梯度标准品，标准品分子量大小,50500 nt,梯度为,25 nt,。,90,变性,2min,，取,1,L,通过,ABI377,测序仪走,4%,含尿素的变性聚丙烯酰胺，从,Sequence Analysis,上进行,AFLP,指纹图谱的分析,数据处理,根据各鸡种基因组,DNA,的,AFLP,标记检测结果，选取清晰可辨的多态性谱带用于数据统计分析。利用,GENESCAN,分析软件根据加入的荧光内标的分子量的大小，从而得到片段的大小。,有带的记为,1,，无带的记为,0,，建立数据库。,利用,SPSS,软件，按公式,GS= 2 Nxy( Nx+ Ny),进行计算各品种间的遗传相似系数,(genetic similarity, ),其中,Nxy,代表两个品种共有的带谱数，,Nx,与,Ny,分别代表每个品种的总带谱数。各鸡种间的遗传距离,(D ),按公式,D=1-GS,计算。根据值，利用,NTSYSpc,分析软件按照,UPGMA,法进行聚类分析。,展望,AFLP,标记技术由于集成了诸多优点,已广泛用于各种生物类型的研究,如动物、植物、微生物以及线虫等等,其主要缺点是显性标记、扩增片段偏短、不能反应标记的位置信息和大规模进行单位点检测等,但随着,AFLP,操作平台构建和方法的完善以及生物测序进展,上述缺点都逐渐得到克服,不仅适用于对序列未知或知之较少的生物类型,而且对序列已知的生物可进行大规模表达分析和信号传导关键组分的筛选,尤其在生物多样性研究、种属特异性鉴定、表达谱分析、精细作图、基因克隆以及甲基化研究等方面具有其它标记技术无可比拟的优势。,Thank You !,