微生物研究进展chapter2-3 微生物基因组学研究进展

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 微生物基因组学研究进展,第一节 微生物基因组与生物信息学,第二节 微生物基因信息的分析,第三节 芯片技术在微生物学领域的应用,农学系生物技术专业课程,微生物学研究进展,第二节 微生物基因信息的分析,一、微生物基因组信息的获得,二、 基因组序列诠释,一、微生物基因组信息的获得,1,、基因组测序及数据处理,DNA,测序的一般方法,序列的组装,2,、从网络数据库获得基因组信息,DNA,测序的一般方法,链终止法测序,化学降解法测序,自动化测序,非常规,DNA,测序,链终止法测序,(,the chain termination method),基本原理,:,通过合成与单链,DNA,互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的,DNA,分子，从而来读取待测,DNA,分子的顺序。,技术路线与要求,制备单链模板,将单链模板与一小段引物退火,加入,DNA,多聚酶,4,种脱氧核苷酸,分别加入少量,4,种双脱氧核苷酸,将,4,种反应产物分别在,4,条泳道电泳,根据,4,个碱基在,4,条泳道的终止位置读出基因序列,A,克隆于质粒中,DNA,用碱或热变性,B M13,克隆单链,DNA,C,噬粒克隆,DNA,D PCR,产生单链,DNA,A,高酶活性,B,无,5,3,外切酶活性,C,无,3,5,外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP,的,3,碳原子连接的是氢原子,不是羟基,化学降解法测序,基本原理,:,在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使,DNA,分子在被修饰的位置降解,.,技术路线,将双,链,DNA,样品变为单链,每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示,DNA,条带,分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降,解,DNA,群体,电泳,读取,DNA,的核苷酸顺序,自动化测序,基本原理,与链终止法测序原理相同,只是用不同的,荧光色彩,标记,ddNTP,如,ddATP,标记,红色,荧光,ddCTP,标记,蓝色,荧光,ddGTP,标记,黄色,荧光,ddTTP,标记,绿色,荧光,.,由于每种,ddNTP,带有各自特定的荧光颜色,而简化为由,1,个泳道同时判读,4,种碱基,.,非常规测序,毛细管电泳,用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法,.,光点测序,脱氧三磷酸核苷酸,连接到,DNA 3-,末端,时会释放,1,个焦磷酸,(,PPi,),焦磷酸,在,磷酸化酶,的作用下转化为化学能,并发出光亮,.,由此,往反应液中每次只加入,1,种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类,;,当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定,DNA,序列,.,DNA,测序胶图,支持毛细管阵列电泳、,DNA,芯片等的测序技术的发展；,DNA,芯片测序,基本原理,将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置,.,待检测的,DNA,分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的,DNA,顺序,.,利用基因芯片进行杂交测序的原理,序列的组装,随机测序与序列组装,随机测序也称,”,鸟枪法”,.,序列组装原理,:,直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸,.,优点,:,不需预先了解任何基因组的情况,.,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,鸟枪法,(Shotgun),测序的问题,CAATGCATTA,GCAGCCAATGC,GAP,错装,Shotgun,法序列拼接,Sequence Gap,实例,:,流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装,超声波打断纯化的基因组,DNA,琼脂糖电泳收集,1.6,2.0Kb,的区段、纯化,构建到质粒载体中,随机挑选,19687,个克隆,进行,28643,次测序,得到可读顺序为,11 631 485,bp,组装成,140,个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,各重叠群间仍有间隙,顺序间隙 物理间隙, ,载体或宿主菌 选用不当而被丢失的顺序,测序时遗漏的测序,解决办法,:,通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库,解决办法,:,利用其它宿主菌与载体重新构建文库,限制测序,限制测序：是指将一段染色体区段的,DNA,顺序进行组装,.,一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法,.,如高等植物,拟南芥基因组的测序,完全依据克隆重叠群,先进行各个,BAC,克隆的随机测序,再进行序列组装；,水稻基因组测序,计划采取得策略与此相同,.,2000,年,6,月公共领域测序计划工作框架图,指导测序与序列组装,建立在基因组图谱基础上的,”,鸟枪法”,即所谓,”,指导鸟枪法,”或”,指导测序”。,先将染色体打成比较大的片段,(,几十,-,几百,Kb),利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群,(,Contig,),分别测序后拼装,.,这种策略叫,基于克隆群,(,contig,-based),的策略,.,A,B,C,A,B,C,大片段,contig,小片段测序拼装,两种策略的比较,鸟枪法策略,指导测序,策略,不需背景信息 构建克隆群,(,遗传、物理图谱,),时间短 需要几年的时间,需要大型计算机,得到的是草图,(Draft),得到精细图谱,其他测序路线,重要区域优先测序,人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序,.,如,:,人类主要组织相容性复合区位于第,6,号染色体,与人类免疫系统有关，因而优先测序,.,EST (Expressed sequence tag),测序,EST,是一种重要的基因组图分子标记,以,EST,为探针很容易从,cDNA,文库中筛选全基因,又可从,BAC,克隆中找到其基因组的基因序列,.,优点,:,A mRNA,可直接反转录成,cDNA,而且,cDNA,文库也比较容易构建,;,B,对,cDNA,文库大量测序,即可获得大量,EST,的序列,;,C EST,为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因,;, 序列的组装,大规模测序的每一个环节都与数据分析紧密相关,过程复杂、工作量大,有效的数据分析算法与软件,大规模测序中的数据分析,大规模测序及,数据分析过程,LocusLink,基因和蛋白质信息的概括性资源,【NCBI】,RefSeq,最稳定、最被承认的基因和蛋白质的序列,【NCBI】,UniGene,给出基因序列、以及图谱信息、同源基因、表达信息,【NCBI】,Entrez,用于提取序列信息，很好的查询、提取和显示系统,【NCBI】,Ensemble,与,Entrez,同样功能的系统,【EBI】,ExPASy,用于获取蛋白质及其相关数据,【 SIB】,（,Swiss Institute of Bioinformatics,）,Every road leads to Rome!,2,、从网络数据库获得基因组信息,例子：,E. coli,K-12,基因组,以使用,Entrez,进行查询为例,查询,Escherichia coli K12,基因组的信息：,DNA polymerase II,二、 基因组序列诠释,第二节 微生物基因信息的分析,1.,寻找基因,2.,获取基因全长,cDNA,序列,3.,实验确认基因功能,4.,微生物基因组信息的分析,是遗传信息的物理和功能单位，包含,产生一条多肽链或功能,RNA,所必需的全部核苷酸序列。,基因分类：,编码,RNA,的基因，如,rRNA,基因，,snRNA,基因等；编码蛋白质的基因,基 因,基因的不连续性,Intron,和,Exon,:,大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序,(,Exon,),都被或长或短的非编码顺序,(,Intron,),隔开,重叠基因,:,同一段,DNA,能携带两种不同蛋白的信息,.,重迭基因有以下几种情况：,*,一个基因完全在另一个基因内部,*,部分重叠,*,两个基因共用少数碱基对,*,一个基因完全在另一个基因内部,如：,B,和,A,，,E,和,D,其读码结构互不相同,-,ATG-,-/-AATGCC -/-ATAACG-/-,TAA,-,A*,B,ATG,CCN-NNA,TAA,*,部分重叠,如：,K,和,C,*,两个基因共用少数,碱基对,如：,D,和,J,-TAATG-,D,终止密码子,J,起始密码子,问题,基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？,基因组作为一个整体如何行使其功能？,用什么方法寻找基因，研究基因的功能？,主要内容：,寻找基因,获取基因的全长,cDNA,序列,确定,DNA,顺序中基因的位置,研究基因的功能,基因表达,蛋白质组学,1.,寻找基因,根据开放读码框预测基因,起始密码子,ATG,第一个,ATG,的确定则依据,Kozak,规则,;,Kozak,规则是基于已知数据的统计结果，所谓,Kozak,规则，即,第一个,ATG,侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。,若将第一个,ATG,中的碱,基,A,，,T,，,G,分别标为,1,2,，,3,位，则,Kozak,规则,可描述如下：,第,4,位的偏好碱基为,G,；,ATG,的,5,端约,15bp,范围的侧翼序列内不含碱基,T,；,在,-3,，,-6,和,-9,位置,，,G,是偏好碱基；,除,-3,，,-6,和,-9,位，在整个侧翼序列区，,C,是偏好碱基。,信号肽分析,信号肽分析软件,(,SignalP,http:/,www.cbs.dtu.dk/services/SignalP,/,),把预测过程中证实含完整,mRNA 5,端的,Contig,翻译为蛋白序列,;,然后用,SignalP,软件对前,50,个氨基酸序列,(,从第一个,ATG,对应的甲硫氨酸,Met,开始,),进行评估，如果,SignalP,分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽,;,假如在该测试序列的第一个,Met 5,端存在,终止密码子,，该序列为信号肽的可能性更大。,终止密码子,终止密码子,: TAA, TAG,TGA,GC% = 50%,终止密码子每,64,bp,出现一次；,GC% 50%,终止密码子每,100,200,bp,出现一次,3,端的确认,3,端的确认主要根据,Poly(A),尾序列，若测试,Contig,不含,Poly(A),序列，则根据加尾信号序列“,AATAAA,”,和,BLAST,同源性比较结果共同判断。,非编码序列、内含子,高等真核生物多数外显子长度不少于,100,个密码子，有的不到,50,个密码子甚至更少。,密码子偏爱性,编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第,3,位碱基不同。,不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（,Ale,）,密码子多为,GCA,GCC,或,GCT,而,GCG,很少使用。,外显子内含子边界,外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：,内含子的,5,端或称供体位（,donor site,）,常见的顺序为,5,AG,GTTAAGT-3,；,3,端又称受体位（,acceptor site),多为,5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”,嘧啶核苷酸，,T,或,C),；,上游控制顺序,几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与,DNA,结合蛋白作用，控制基因表达。,另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有,CpG,岛。,软件预测,采用,NCBI,的,ORF,预测软件,( ORF finder: http:/,www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi,),判断,ORF,的可能范围。,mRNA,的,5,端即转录起始位点区,通过同源性比较来预测,mRNA,的,5,端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库,(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/,www.epd.unil.ch,/ ),。,同源查询途径,通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。,同源有如下几种情况：,A DNA,序列某些片段完全相同；,B,开放读码框（,ORF,）,排列类似，如有长外显子；,C,开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；,D,模拟多肽高级结构相似,试验分析,Northern,杂交确定,DNA,片段是表达序列：,注意事项：,a,当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；,b,考虑组织专一性和发育阶段的问题。,C,基因表达产物丰度的问题,如果风度较低，用拟,Northern,杂交和动物杂交（,Zoo-blotting,）,分析。,拟,Northern,杂交,根据已知的,DNA,顺序设计引物，从,mRNA,群体中扩增基因产物，再以,DNA,为探针与之杂交。,动物园杂交,根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的,DNA,顺序与来自另一亲缘物种的,DNA,片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有,1,个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交,。,2.,获取基因全长,cDNA,序列,A,构建,cDNA,文库，用目的基因,DNA,片段筛选文库。,B,根据已知片段设计引物，,RACE,技术得到基因的全长,cDNA,序列。,cDNA,文库构建,cDNA,文库构建,5RACE,3RACE,3.,实验确认基因功能, 基因敲除,(knock-out),最简便的基因失活的方法,.,主要原理,:,在一段无关,DNA,片段的两侧连接与替换基因,两侧,相同的顺序，将这一构建导入目的细胞，由于,同源片段之间的重组,，可使无关片段取代靶基因，整合到染色体中。为了便于筛选，用于取代的外源,DNA,中,含有报告基因,。,基因超时表达,通过增加,基因的拷贝数和采用强启动子,促使基因超表达，致使受体表现出生长与发育的异常，来研究基因的功能。, 基因转导技术,导入细胞，观察功能。,该方法用的最多，技术最成熟。,比较基因组学,(Comparative Genomics),概念：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。,4.,微生物基因组信息的分析,功能基因组学研究,利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。,