PCR技术与应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR技术及其应用,1,目 录,PCR技术简史,PCR的原理,PCR的反应体系和方法,PCR的类型和应用,2,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,3,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA引物,RNA引物,4,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,5,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,6,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）,基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制,最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,7,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,8,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,9,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,10,DNA聚合酶,引物,引物,M13噬菌体,Sanger的测序技术,引物,DNA聚合酶,11,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,12,94,变性,50-65,退火,XX,延伸,13,94,55,37,14,Taq,DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度,(),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,15,72,94,55,PCR循环,16,PCR的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0,.,12ug,Taq DNA聚合酶 2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,17,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,18,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,子链延伸,DNA加倍,DNA变性,形成2条单链,模板DNA,95,19,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,引物1,引物2,DNA引物,20,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,21,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,95,第2轮开始,22,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,23,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,24,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,25,PCR的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(,ug,=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,26,引物设计,：,（,1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。,（2）引物长度以15-40 bp为宜。,（3）,碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。,（4）引物内部避免形成二级结构。,（5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,27,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,28,1）PCR反应成分,（1）模板,单、双链DNA均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,一般100ng DNA模板/100,L。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,29,（2）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,（3）Taq,DNA聚合酶（thermus aquaticus),0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,30,（4）dNTP,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,四种dNTP浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP可与Mg,2+,结合，使游离的Mg,2+,浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,31,（5） Mg,2+,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg,2+,浓度。,32,2）循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,33,（3）延伸,70-75,o,C，,延伸时间由扩增片段长度决定,（4）循环次数,主要取决于模版DNA的浓度,一般为25-35次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,34,PCR的类型和应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,35,1）不对称PCR,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。,方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。,用途：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组DNA结构功能的研究,36,高浓度引物,低浓度引物,37,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,38,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,39,3）多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,40,41,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,42,标记引物,观察,PCR产物,43,5）锚式PCR,已知靶基因片段两测的序列,44,VH,CH1,CH1,CH2,CH2,CH3,CH3,VH,VL,VL,CL,CL,45,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,46,6）PCR固相分析法,模板,生物素化引物,PCR扩增,探针,亲和固相介质,检测探针信号,47,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,48,原位PCR的作用,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。,ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,49,操作步骤,细胞或组织的固定,PCR扩增细胞内目的片段,原位杂交检测扩增产物,50,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,51,8）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,52,基因,mRNA,蛋白质多肽链,53,实时PCR技术原理,54,PCR技术的应用,1) 基因克隆,重组DNA,质粒DNA,基因片段,55,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,56,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,CCTG,GGAC,GTCC,CAGG,质粒DNA,目的基因,限制性核酸内切酶,57,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),58,遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,59,A,正常人,病 人,正常,病人,60,ASO探针法,A,C,T,G,ASO探针,正常,病人,61,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,62,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,63,突变,限制性内切酶,64,正常,突变,电泳,65,HLA系统基因分型,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3)基因配型,66,PCR-SSP,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,67,4）基因,鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,68,法医学分析,个体识别、亲缘鉴定,方法：PCR-RFLP,DNA遗传指纹,PCR-ASO,PCR-VNTR多态性,PCR-SSCP,线粒体DNA测序,69,PCR-VNTR多态性检测,PCR；电泳检测,70,父 父 子 母,71,现 嫌1 嫌2 嫌3,72,