DNA粗提取与鉴定(用)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA的粗提取与鉴定,1,目的要求,1、了解从细胞中提取DNA的基本原理,2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法,3、观察提取出来的DNA,2,实验思路,1、DNA从哪提取？,2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？,3、怎样鉴定我们提取的DNA？,3,实验原理,1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当,NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。,利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。,2.DNA不溶于酒精溶液,，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色,，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,4,实验材料和用具,实验材料：,1、鸡血细胞液（510ml）；,2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；,3、蒸馏水；,4、质量浓度为0g/ml的柠檬酸钠溶液； （抗凝剂）,5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液；,6、二苯胺试剂。,5,实验用具：,铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,6,7,8、DNA的鉴定, DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,紫外灯照射法,A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）,B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色,C、将蜡纸放在紫外灯,(260 nm),下照射（暗室中），可见橙红色的荧光,(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处),甲基绿 （蓝绿色）,8,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：新鲜的鸡血,注意：,本实验中，,要往鸡血中加入抗凝剂,（,柠檬酸钠溶液,）,原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,9,(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞,(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,利用了什么原理？,2、过滤，获取含DNA的滤液,10,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,11,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。,12,（四）,DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为95）,，静置2-3min，溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,13,14,2、 DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入,二苯胺,4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有,蓝色,15,小结,1、DNA的粗提取与鉴定的方法,2、原理,3、实验设计的步骤，原则,作业,尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这个实验。,16,1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ ）,A .防止凝血 B. 加快DNA析出,C .加快DNA溶解 D.加速凝血,练一练,A,17,2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（ ）,A 2mol/l B 0.1mol/l,C 0.14mol/l D 0.015mol/l,3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ）,A 加快DNA溶解的速度,B 加快溶解杂质的速度,C 减小DNA的溶解度，加快DNA析出,D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,18,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是,A 减小;减小 B 增大;增大,C 先减小后增大 D增大; 减小,5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是,A 加蒸馏水 B 加矿泉水,C 加清水 D 加生理盐水,19,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是,A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度,B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整,C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度,D 当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,20,8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴）,A 硅红色 B 红色 C 紫色 D 蓝色,D,21,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,22,2、实验原理, DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,23,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的,柠檬酸纳溶液（抗凝剂）,100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,24,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca,2+,发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca,2+,大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,25,讨论：提取鸡血中的,DNA时，为什么,除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用,玻璃棒,充分搅拌5 min，,使血细胞加速破裂。,然后，用放有,纱布的漏斗,将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,26,27,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？,得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的,DNA,28,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用,玻璃棒沿一个方向搅拌,1min，使其混合均匀，这时,DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用,玻璃棒不停地轻轻搅拌，,这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,29,30,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,31,滤取含DNA的粘稠物,用放有,多层纱布,的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的,粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，,用玻璃择不停地搅拌，,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,32,33,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有,两层纱布,的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入,冷却的、酒精的体积分数为 95,的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用,玻璃棒搅拌，,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,34,35,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,36,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，,用玻璃棒搅拌，,使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA的鉴定,37,38,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,39,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：,细胞吸水胀破,第一步,第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,40,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次： DNA存在于滤液里 第一步,第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步,41,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,42,（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,43,（二）,案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min,44,研磨液的配制方法如下：将10.1 g Tris加入到50 mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL,Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）,EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA,SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离,45,过滤：,在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：,将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,46,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,47,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析DNA中的杂质,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,48,